重组腺病毒Ad—hTERTp-HSV—TK／GCV系统的构建及其对人肝癌细胞HepG2的杀伤作用及旁观者效应研究.pdf
重组腺病毒Ad—hTERTp-HSV—TK／GCV系统的构建及其对人肝癌细胞HepG2的杀伤作用及旁观者效应研究.pdf
中国癌症杂志
CHINA ONCOLOGY
2009年第19卷第1期
2009 Vo1．19 No．1 29
重组腺病毒Ad-hTERTp—HSV—TK／
GCV系统的构建及其对人肝癌细胞
Hep G2 6~杀伤作用及旁观者效应研究
[摘要 ] 背景与目的：肝癌的基因治疗己成为肝癌治疗的重要发展方向，本文探讨Ad—hTERTP—tSV—TK／
GCV系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用；并观察其过程中旁观者效应的作用。方法 ：用重组腺病毒Ad—
hTERTP-HSV—TK系统分别感染肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞L—O2，加入前体药物更昔洛韦 (GCV)，四甲基偶
氮唑盐比色法检测其对感染后细胞的杀伤作用；将感染后的TK阳性HepG2gm胞和未感染的TK阴性HepG2~胞按不
同比例浓度 (0：10、1：9、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2、9：1、10：0)混合，观察其旁观
者效应。结果：肝癌细胞HepG2的存活率随病毒感染复数 (MOI)SUGCV浓度增加而逐渐降低，L—O2细胞无明显
变化。旁观者效应表明，在TKI~H性HepG2f~胞为10％时，细胞抑制率达28．06％， 70％时达90．44％。结论 ：重组腺
病Ad—hTERTP—HSV—tk／GCV系统对肝癌细胞HepG2有选择性杀伤作用及明显的旁观者效应。
[关键词 ] 基因治疗； 肝肿瘤； 重组腺病毒载体； hTERT启动子； 自杀基因； 培养的肿瘤细胞
中图分类号：R73—36 2 文献标识码：A 文章编号：1007—3639(2009)01—0029—04
Lethal and bystander effects of recombinant adenoviruses with hTERlTP—HSV-TK／GCV system on
human hepatocellular carcinoma cells HepG2 LIU Yan，DENG Zhi-hua，VA Chang—qing,LIU／ing一
1ong,JIA Jing,GUo Su—ya．YANG @iang IDepartment of Gastroenterolog)5 Second ttospi tal of
Shanxi礁edicaI University Taiyuan Shanxi 030001 China)
Correspondence to：DENG Zhi-hUa E-mail：vkdzh@ahoo com．cn
[Abstract] Background and purpose：Gene therapy has become more and more popular in the treatment of
hepatocellular carcinoma．We observed the lethal effect of Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV system and its bystander effect
on the hepatocelular carcinoma cels HepG2．Methods：Firstly．proliferation of the HepG2 cells and the L—O2 cells
was assayed by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)after they were transducted by the recombinant adenovirus and
GCV were added of different concentrations．Secondly，we observed the inhibition ratio on HepG2 cells after mixing
the transducted HepG2 cells and the non—transducted HepG2 cells．Results： The survival rate of the HepG2 cels was
decreased folowing the increase of the MOI and the concentration of GCV The bystander effect was signifcant．the
90．44％ of HepG2 cells were inhibited when 70％ 0f HepG2 cels were transducted． Conclusion：The Ad—hTERTp．
HSV．TK／GCV system can selectively inhibit the HepG2 cells and has a signifcant bystander effect on them．
[Key words] gene therapy； hepatocelular neoplasm； adenovims vector； hTERT promoter；
suicide gene； cultured tumor cels
端粒酶基因特异地转录并表达于多数肿瘤
细胞中，而在正常组织细胞中不能检出端粒酶
的活性形式。研究表明，端粒酶激活是肝细胞
癌变过程中的早期事件 ̈，与肝癌密切相关，其
阳性率在肝癌达85％以上，使我们利用人端粒酶
逆转录酶启动子 fhuman telolnerase reverse tran一
基金项目：国家自然科学基金(No．30672405)。
通讯作者：邓志华 E-mail：ykdzh@yahoo com．cn
scriptase promoter，
疗成为可能。
hTERTp)实现肝癌的靶向治
自杀基因又称前药敏感基因，将自杀基因导
人肿瘤细胞，可将无毒性药物前体在肿瘤细胞
内代谢为毒性产物，进而杀伤肿瘤细胞。自杀基
因种类很多，其中单纯疱疹病毒胸苷激酶系统
(HSV—TK)最常见 ，它可将无毒性的前
体药物更昔洛韦 (gancielovir GCV)磷酸化为三
3O 刘燕，等． 重组腺病毒Ad—hTERTp～HSV—TK／0CV系统的构建及其对人肝癌细胞Hep62的杀伤作用及旁观者效应研究
磷酸更昔洛韦 (GCV—TP)，抑制细胞DNA聚合
酶，从而阻断核酸代谢途径，导致细胞死亡，
该系统已被美国FDA批准进入Ⅲ期临床试验，
有广泛的应用前景。
腺病毒载体与非病毒载体如脂质体等相
比，具有高感染效率、作用持久等优点，应用
于肿瘤的基因治疗已取得较好效果 。。
本研究将通过观察重组腺病毒介导的人端
粒酶逆转录酶启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激
酶基因联合更昔洛韦 (Ad—hTERTp—HSV—TK／
GCV)系统XCHepG2~H胞的抑制作用，为肝癌
的基因治疗提供新的思路。
1 材料和方法
1．1 材料 HEK293~胞购自中科院上海细胞
所，肝癌细胞HepG2、正常肝细胞L—O2、穿
梭质粒 pSU—Tp—TK为我校微免教研室保存，
含5型腺病毒骨架质粒pBHGE3购自加拿大Mi—
crobix Biosystems公司。MTT、GCV为Sigma公
司产品。DMEM培养液、胎牛血清购自GIBCO
公司。腺病毒纯化试剂盒购自Clontech公司。
TGL一16C高速离心机购自上海安亭科学仪器
厂。
1_2 方法
1．2．1 细胞培养 HEK293细胞 、肝癌细胞
HepG2、正常J]t：-~fH胞L一02在含l0％胎牛血清的
高糖DMEM培养基中，37 oC、5％CO，，湿润条
件下培养。
1．2．2 重组Ad—hTERTp—HSV—TK表达载体
的构建 将HEK293~胞接种于25 cm 培养瓶，
待细胞融合率达到80％～90％时，用无血清
DMEM冲洗l遍，将穿梭质粒pSU—Tp—TK与含5
型腺病毒右臂的骨架质粒pBHGE3J[I／k无血清
DMEM~匀，再通过Lipofectaminen 2ooo~质
体共转导至HEK293~胞，37 oC、5％CO，，湿
润条件下培养90 rain，再加人完全DMEM培养
基，每3天换液1次，l0 d后出现病毒空斑，收
集细胞，反复冻融裂解，用病毒DNA提取试剂
盒提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定。
1．2．3 P C R鉴定 以提取的腺病毒D NA
作为模板，用h T E R T P引物和 T K 引物进
行P C R鉴定 。h T E R T P基 因 ：上 游引物
5’一GTCGACAGTGGATTCGGGCACGGA一3’：
下游引物 5’一AAGCTTAGGGCTTCCCA
C GT G C G C A G一3’；T K 基因 ：上游引物
5'-ATGGCTTCGTACCCCTGCCATC一3’；下游引
物5'-TTAAGCCTCCCCCATCTCCCGG一3’；反应
条件：94 cC预变性3 min后 ，94℃变性30 s，59
40 S，72℃ 180 S共30个循环，循环结束后72
℃再延伸10 min。
1．2．4 Ad—hTE1LTp—HSV—TK的扩增、纯化
及滴度测定 PCR鉴定正确后，将首次扩增的
Ad—hTERTp—HSV—TK病毒原液0．5 1加入到
1 ml无血清的DMEM培养基中，混匀后重新感
染 HEK293细胞，于37 oC 5％CO，温箱中培养
72 h，待细胞出现细胞变圆、伪足收缩等典型
的细胞病变 (cytopathic efect，CPE)效应后，
收集细胞，反复冻融3次，并高速离 t~,30 min，
收集上清，按腺病毒纯化试剂盒说明书纯化病
毒液。纯化后再采用50％组织培养感染剂量法
(TCID )测定病毒滴度。
1．2．5 四甲基偶 氮唑盐比色法 (MTT法 )检
测细胞存活率 将肝癌细胞HepG2和正常肝细
胞L一02按1．5 X 10 I：fL接种于96孔培养板，待细
胞贴壁后 ，重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK
按MOI=0、1、10、100、1 000分为5组分别转
导，温育24 h后，加入含不同浓度GCV(0、
l、10、100、1 000 g／m1)的新鲜培养液，
每个浓度设3个复孔，48 h后每孑L加20 l MTT
液温育4 h，弃上清液，每孑L再加入100 1
DMSO，轻轻摇晃10 min，酶标仪测定 值。细
胞存活率％=(／4试验组，4对照组)X 100％。
1．2．6 旁观者效应的检 测 将感染 A d—
hTERTp—HSV—TK的 HepG2细胞(TK~H性)和未
感染的 HepG2细胞 (TK阴性 )按不同比例浓
度(0：1O、1：9、2：8、3：7、4：6、5：5、
6：4、7：3、8：2、9：l、10：0)混合，以
1．5 X 10 I：fL接种于96：~L板培养，每孔设3个复
孑L，24 h后加入含GCV(100 g／m1)的新鲜培
养液，作用48 h后，MTT法测定细胞生长抑制
率。
1．3 统计处理 计量资料用均数 ±标准差表
示，应用 SPSS15．0统计软件进行数据分析，用
方差分析方法进行统计学处理。以P<O．05为差
异有显著性。
2 结 果
2．1 pSU—Tp—TK酶切及Ad—hTERTp-HSV—
《中国 癌 症 杂 志》 2 0 0 9 年第 1 9 卷 第 l 期 3 1
T K P C R 鉴 定 结 果 分 别 以 T K 基 因 和 h T E R T p
基 因 引 物 作 P c R 鉴 定 ， 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 出
现 3 0 0 h p 和 l 1 4 3 h p 清 晰 条 带 ， 与 p s u — T p —
T K 双 酶 切 后 的 T K 和 h T E R T p 片 段
一 致 ．
N P T M
6 0 0 bp
5 0 0 bp
4 0 0 bp
3 0 0 bp
2 0 0 bp
1 0 0 bp
F i g ． 1 T K g e n e b y P C R
N ：N e g a t i V e c o n t m I；P ：p S U
— T p
- T K ：T ：T K g e n e b y P C R ：M ：M a r k e r
N P H M
F i g ． 2 h T E R T p g e n e b y P C R
2 o o O bp
1 0 0 0 bp
7 5 0 bp
5 0 0 bp
2 5 0 b p
l o o b p
N ： N e g a t l V e c O n t r O l ：P ： p S U
— I p
— l K ：H ： h I
’
E R l p g e n e b y P C R ：M ：
M a r k e r ．
2 ． 2 病 毒滴 度 的测 定 A d — h T E R T p — H s V — T K
经 扩 增 并 纯 化 后 ， 5 0 ％ 组 织 培 养 感 染 剂 量 法
( T c I D 5 (】) 测 定 病毒滴 度 为 1 ． 5 × l O
“’
p f l 】／m l ， 可
以 满足 实验 要 求 。
2 ． 3 M T T 法 检 测 细 胞 存 活 率结 果 M T T 结 果 显
示 ： 以 不 同感 染 复 数 ( M O I ) 的A d — h T E R T p —
H S V — T K 感 染 肝 癌 细 胞 H e p G 2 和 正 常 肝 细 胞
L 一 0 2 ， 并 给予 不 同浓 度 的G C V 后 ， 随重 组 腺病
毒 M O I 和 G C V 浓 度 的增 加 ， 肝 癌 细 胞 H e p C 2 的
存活率逐 渐 降低 ， 差 异有显 著性 ( 尸 < 0 ． 0 1 ) ，
而 正 常肝 细胞L 一 0 2 的存活 率未 见 明显 改 变 j
摹
苗
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一
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． 兰
}
鲁
∞
=
乜)
U
l 1 0 1 0 0 1 0 0 0
G C V (腿 ／m 1)
图3 A d — h T E R T p — H S V — T K ，G C V 对 H e p G 2 细 胞 的抑 制
作 用
F i g ．3 T h e i n h ．b i t O r y e f lf e c t 0 f A d — h T E R T p
- H S V — T K ／
G C V s y s t e m 0 n H e p G 2 c e IIs
— ． 一 0
一 I
— � 一 10
十 1 0 0
十 1 0 0 0
M 0 1
0 l 1 0 1 0 0 l OOO
G C V (鹇 ／m 1)
图4 A d — h T E R T p — H S V — T K ／G C V 对 L — 0 2 细胞 的抑 制 作
用
F i g ． 4 T h e i n h ．b ．t o r y e f lf e c t o f A d
— h T E R T p
— H S V — T K ／
G C V s y s t e m 0 n L - 0 2 c e I l s
2 ． 4 旁 观 者 效 应 检 测 结 果 T K 阳 性 H e p G 2 细
胞 和 T K 阴 性 H e p G 2 细 胞 按 不 同 比 例 混 合 后 ，
细胞 受 到 明显 抑 制 ， T K 阳性 H e p G 2 细 胞 为 1 0 ％
时 ， 细 胞 抑 制率 已 达 ( 2 8 ． 0 6 ± 2 ． 3 8 ) ％ ， 而 为
7 0 ％ 时 ， 则达 ( 9 0 ． 4 4 ± 3 ． 0 4 ) ％ ， 表 明小 部 分
T K 阳性 H e p G 2 细 胞 即可 引起 大 部 分细胞 发 生 凋
亡 ， 旁观 者效应 明显 。
T K p o s i t i v e c e l l s r a t e
图5 旁 观 者效应 检测 结 果
F i g ． 5 T h e e x p e r i m e n t a l r e s u I t s o f t h e b y s t a n d e r e f f e c t 0 n
H e p G 2 c e IJ s
3 讨 论
原 发 性 肝 癌 是 最 为 难 治 的恶 性 肿 瘤 之 一 。
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一更 一
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32 刘燕，等． 重组腺病毒Ad hTERTp—HSV TK／GCV系统的构建及其对人肝癌细胞HeDG2~t~杀伤作用及旁观者效应研究
恶性程度高，手术后复发和转移发生率高，目
前尚缺乏有效的解决手段 。肝癌的自杀基
因治疗将为常规治疗手段无能为力的晚期和复
发转移患者带来新的希望。
本研究证实，重组腺病毒Ad—hTERTp—
HSV—TK／GCV系统对端粒酶阳性的 HepG2细
胞有明显的抑制作用，且随重组腺病毒 MOI和
GCV浓度的增加，肝癌细胞 HepG2的存活率
逐渐降低 ，差异有显著性 (P<0．O1)，正常
肝细胞 L一02的存活率未见明显改变，在病毒
MOI=1 000，GCV为100 g／mlH~，该系统对
HepG2细胞的抑制率可高达90．02％，而 L一02
细胞的抑制率仅为10．0I％；提示Ad—hTERTp—
HSV—TK+GCV对肝癌细胞 HepG2有靶向杀伤
作用，且杀伤作用随MOI和 GCV浓度的增加而
逐渐增强，而对正常肝细胞 L一02则无影响。
此外我们还证实，HSV—TK／GCV系统不仅能杀
死被转染的TK阳性 HepG2细胞，还能杀死周
围未被转染的TK阴性 HepG2细胞，称为旁观
者效应，且TK阳性 HepG2细胞为10％1t,j"，抑
制率即达到 (28．06 4-2．38)％。目前旁观者效
应的作用机制还不清楚，可能通过细胞缝隙连
接、诱导细胞凋亡和免疫炎症反应等引起远距
离杀伤作用 " 。
总之，基于hTERT启动子的肿瘤特异性，
利用hTERT启动子介导抗癌基因 ，如Ad—
hTERTp—HSV—TK／GCV系统，实现肿瘤的靶
向性基因治疗是一种很有前景的策略。当然，
Ad—hTERTp—HSV—TK／GCV 系统在广泛应用
于临床的过程中仍还存在诸多问题：首先，
端粒酶hTERT启动子作用的分子机制和活性
调节机制还不清楚，还需进一步研究；其次，
Ad—hTERTp—HSV—TK／GCV的病毒载体系统在
肿瘤临床治疗中的疗效及安全性问题还有待
进一步考证。但是，近年一些研究者利用Ad—
hTE~Tp—HSV—TK／GCV系统与传统治疗方法联
合应运于肿瘤的临床治疗中，已经取得了较好
的效果。因此，我们有理由相信，hTERT启动
子将凭借其特异性与靶向性及腺病毒载体的高
效性等优点，使Ad—hTERTp—HSV—TK／GCV系统
在肿瘤基因治疗中发挥越来越重要的作用，并将
成功应用于肿瘤临床治疗中。
[参 考 文 献]
1 2 3 4 5 6 7 8 9
...
