食管癌细胞系对光敏剂Photofrin-Ⅱ的吸收和排出研究.pdf
食管癌细胞系对光敏剂Photofrin-Ⅱ的吸收和排出研究.pdf
!癌症" !"#$%&% ’()*$+, (- .+$/%*# 0112# 03$40%&506375086
!食管癌专栏!
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$摘 要% 背 景 与 目 的#肿 瘤 高 选 择 性 摄 入 光 敏 剂 的 原 因#即 靶 向 原 理 至 今 仍 不
清楚$ 本 研究探讨肿瘤细胞对光敏剂的亲和力$ 方法#应用紫外分光光度仪测定
各 种 细 胞 培 养 液 的 吸 收 光 谱% 应 用 荧 光 分 光 光 度 仪 对 光 敏 剂 9"(:(-*#$;!进 行 荧
光 光 谱 分 析# 同 时 测 定 人 永 生 化 食 管 上 皮 细 胞 系 <=>> 及 其 癌 变 细 胞 系 <=>>.
在相同浓度和时间点对 9"(:(-*#$;!的吸收 和 排 泄$ 结 果#9"(:(-*#$;!的 最 大 荧 光
激发波长为!?28@1AB@8"$C#最大荧光发射波长为!D?6@5AB@8"$C%光敏剂 9"(:(-*#$;
!所 需 要 的 D?B $C 激 发 波 长 的 光#可 完 全 通 过 各 种 细 胞 培 养 液$ 相 同 浓 度 和 时
间 下 #<EFF 细 胞 和 <EFF. 细 胞 对 9"(:(-*#$;!的 吸 收 和 排 泄 差 异 无 统 计 学 意 义
!!GB@B8"%<EFF 细 胞 和 <EFF! 细 胞 对 光 敏 剂 9"(:(-*#$;!的 吸 收 量 均 随 其 浓 度
的 增 加 而 增 加 #?B "H I CJ 后 进 入 平 台 期 %<EFF 细 胞 和 <EFF. 细 胞 对 光 敏 剂
9"(:(-*#$;!的 吸 收 量 随 着 孵 育 时 间 的 延 长 而 增 高 #58B C#$ 后 进 入 平 台 期 %
9"(:(-*#$;!在 <EFF 细 胞 和 <EFF. 细 胞 内 可 保 持 较 高 水 平 58K?1 C#$# 然 后 迅
食管癌细胞系对光敏剂 <5+$+=%2->!的吸收和
排出研究
高社干 5"0" 王立东 5" 冯笑山 5"0" 曲智锋 0" 单探幽 0" 谢萱虎 0
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]"(@\/’7 ^-#Y <5’@_*- C"5’Y 5’9 [-5’@D- [(/Y
5@ 郑州大学基础医学院
癌症研究室"
河南省食管癌重点开放实验室"
河南 郑州 681180
0@ 河南科技大学第一附属医院
肿瘤科"
河南科技大学肿瘤研究所"
河南 洛阳 6L511?
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通讯作者# 王立东 冯笑山
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基 金 项 目# 国 家 自 然 科 学 基 金 项
目 $V(@?BDLB28D%
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Q()$M+:#($ (- ."#$+ $V(@
?BDLB28D%
收稿日期#0BB3;B2;4D
修回日期#0BB2;BD;BL
!"#$
C M Y K
高社干!等! 食管癌细胞系对光敏剂 "#$%$&’()*!的吸收和排出研究
光动力疗法!"+$%$,-)./(0 %+1’."-" 234#是近
56 年发展起来的一 种 新 的 治 疗 恶 性 肿 瘤 的 方 法"
其独特的优点是能选择性地消灭局部肿瘤而不危
及 正 常 组 织"而 且 并 发 症 少$实 施 简 便$可 反 复 实
施 %7&’ 894 的基础是肿瘤组 织 能 选 择 性 摄 取 光 敏
剂"病灶部位光敏剂浓度相对正常组织高( 然而"
光 敏 剂 优 先 聚 集 于 肿 瘤 细 胞 的 机 制 尚 不 完 全 清
楚"可能与肿瘤细胞营养不良$缺乏卟啉类物质有
关"也可能与肿瘤细胞的高增生速率$淋巴引流异
常$ 血管泄漏或光敏剂与新生物细胞上标志性分
子之间较特异性的相互作用!肿瘤细胞亲和力)有
关"如线粒体$溶酶体等细胞器可能存在对光敏剂
的高亲合力 %5&( 此外"肿瘤分泌的血管内皮生长因
子在光敏剂的集聚中也可能起重要作用* 由于大
多数卟啉类光敏剂局限于肿瘤血管内" 而且 894
首先表现为肿瘤血管损伤" 因此光敏剂与肿瘤血
管 的 特 异 性 相 互 作 用+肿 瘤 血 管 亲 和 力)"也 可 能
是光敏剂集聚的原因 %5&(
人永生化食管 上 皮 细 胞 系 :;<< 仍 保 留 原 代
鳞 状 上 皮 细 胞 的 特 征 " 它 的 癌 变 细 胞 系 :;<<=
与 :;<< 细 胞 相 比 既 有 其 同 源 性"又 具 有 肿 瘤 特
征"可 在 体 外 实 验 中 用 来 研 究 肿 瘤 细 胞 对 光 敏 剂
的 亲 和 力 是 否 比 正 常 细 胞 有 着 更 独 特 的 优 势 "且
完 全 排 除 血 管 亲 和 力 因 素( 光 敏 剂 "+$%$>’()*!是
美 国?9@ 唯 一 批 准 用 于 临 床 治 疗 肿 瘤 的 光 敏 剂"
与 第 一 代 光 敏 剂 血 卟 啉 衍 生 物 !+1/.%$"$’"+-’()
,1’(A.%(A1";89)相比"其肿瘤光生物活性更高"毒副
作用更小%B&"非常适合光敏剂吸收排出规律的研究(
本实验以 :;<< 细胞及 :;<<= 细胞为研究对
象"采用荧光分光光度法检测不同孵育浓度,不同
孵 育 时 间 下 :;<< 细 胞 及 :;<<= 细 胞 内 光 敏 剂
"+$%$>’()*!的荧光含量"以及一定浓度 "+$%$>’()*!
孵 育 后 不 同 时 间 点 :;<< 细 胞 及 :;<<= 细 胞 内
"+$%$>’()*!的 荧 光 含 量 " 以 明 确 :;<< 细 胞 及
:;<<= 细胞对 "+$%$>’()*!的吸收$排出规律"探讨
肿瘤细胞与正常细胞比较对光敏剂是否具有特殊
的亲和力"为体外细胞培养的光动力实验研究选择
最佳光敏剂剂量和最佳光照时机提供实验依据(
! 材料与方法
!"! 实验对象
:;<< 细胞及 :;<<= 细胞由中国疾病预防控
制中心病毒病预防控制所曾毅院士和汕头大学医
学 院 沈 忠 英 教 授 建 株 %C"D&并 连 续 培 养 传 代( :;<<
细 胞 的 表 型 仍 保 留 原 代 上 皮 细 胞 培 养 的 特 征"表
现为单层生长和锚锭依赖性生长" 在软琼脂培养
不形成克隆" 接种裸鼠未成瘤( 从生物学行为看
来":;<< 细胞系接近于其来源细胞" 保存其增殖
能力和分化的潜力(在 :;<< 细胞的基础上通过促
癌 物 十 二 烷 基 葵 豆 寇 !E5*F*%1%’.,1.)$-G*"+$’H$G*
EB*.01%.%1"48@) 诱导" 使 :;<< 细胞发生恶性转
化"从而建立了食管癌细胞系 :;<<=%I&(
!"# 主要试剂及配制
光 敏 剂 "+$%$>’()*! 由 加 拿 大 :()0G.(’
8+.’/.01J%(0.GK 公 司 生 产 "LD /M N 支 "CO 避 光 保
存*胎牛血清为美国 P(H0$ 公 司 产 品*胰 蛋 白 酶 为
美 国 ;-0G$)1 公 司 产 品*QERR 细 胞 培 养 基 为 美 国
P(H0$ 公司产品(
8S: 贮存液!ETU)常规配置后"室温密封保 存
备用*8S: 使用液配制后 CO密封保存备用* 细胞
冻 存 液 随 配 随 用*抗 生 素 溶 液!ETTU)配 制 后 按 每
份 D /V 分 装"W5TO密 封 保 存 备 用*QERR 培 养 液
配制后按每份 5TT /V 分装"W5TO保存备用*QERR
完全培养液配制后 CO密封保存备用*胰蛋白酶溶
液 配 制 后 按 照 E /V 的 的 量 分 装 成 小 瓶"W5TO密
封保存"临用时将其用 8S: 液稀释成 E N C 浓度(
!"$ 主要设备
荧光分光光度仪!?*BTET 型)为日本 ;X4@=;X
公 司 产 品"紫 外 分 光 光 度 仪 !YZ*[5TE 型 )为 日 本
:;XQ@9\Y 公司产品"=F5 孵育箱!Q=F*ELD 型)为
日本 :@]^F 公司产品"倒置生物显微镜!4<[TTT*
Y 型) 为日本 ]X_F] 公司产品" 低温冰箱!Q9?*
BBT 型 ) 为 日 本 :@]^F 公 司 产 品 " 血 球 计 数 板
!‘S_*[D 型)为上海医用光学仪器厂产品"细胞培
养瓶$细胞培养板为法国 ?@V=F] 公司产品(
!"% &’()(*+,-.!的吸收实验
EaCaE "+$%$>’()*!荧光 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 的 测
定 用不含胎牛血清的 QERR 培养液将 "+$%$>’()*!
配制成 BT "M N /V 的浓度" 在 ?*BTET 型荧光分光
光度仪上自动扫描"波长范围 5TTbcTT )/"灵敏度
为 dTa7 )/"夹 缝 BaB )/"测 出 "+$%$>’()*!的 最 大
速 排 出( 结 论! 光敏剂在肿瘤组织中浓集现象可能 与 肿 瘤
细胞亲和力无关系(
关键 词!食 管 肿 瘤* 细 胞 系* :;<<* :;<<=* 光 动 力 治 疗*
"+$%$>’()*!
中图分类号!eLB*BD 文献标识码!@
文章编号!7TTTWCIL‘!5TTR)75W75CcWTL
!"#$
C M Y K
荧光激发波长和最大荧光发射波长!
!"#"$ 培 养 用 液 的 吸 收 光 谱 测 定 " % # 分 别 收
集&!’’ 培 养 液 $&!’’ 完 全 培 养 液 $()* 液 $细 胞
培 养 过 程 中 收 集 的 残 余 培 养 基%在 +,-$$.! 型 紫
外 可 见 光 分 光 光 度 仪 上 检 测 上 述 溶 液 对 波 长 为
$$./0.. 12 光 的 透 射 率 ! 靶 细 胞 实 际 接 受 光 剂
量 的 计 算 公 式&靶 细 胞 实 际 接 受 的 光 剂 量 3 体 外
光 照 系 统 光 源 的 光 照 剂 量4细 胞 培 养 液 的 投 射
率!
!"#"5 *677 细胞及 *6778 细胞吸收 9:;<;=>?1-!
情况的检测 *677 细胞及 *6778 细胞在含 !.@
小 牛 血 清 的 &!’’ 细 胞 培 养 液 于 5%A$B@ 8C$ 孵
育箱中常规细胞培养$传代 "0#! 分别取对数生长期
的 *677 细 胞 及 *6778 细 胞 %."$B@胰 蛋 白 酶 液
消化%配成 !".D!.B 个 E 2F 的细胞悬液%接种于 G 孔
细胞培养板%每孔 ! 2F! 置于 5%A$B@ 8C$ 孵 育
箱中继续培养 $# :% 将 *677 细胞及 *6778 细胞
分别随机分成 #5 组%每组 5 复孔%()* 液冲洗 5 遍!
吸收浓度检测组&其中 !5 组 *677 细胞及 *6778
细 胞 在 避 光 条 件 下 更 换 为 不 含 胎 牛 血 清 的 &!’’
液配制的 9:;<;=>?1-!% 光敏剂最终浓度分别为 .$
B$!.$!B$$.$5.$#.$B.$G.$%.$0.$’.$!.. "H E 2F%
置于 5%A$B@ 8C$ 恒温培养箱中培养 !$. 2?1 后%
取出培养板%用 ()* 冲洗 5 遍! 采用胰蛋白酶消化
加低渗裂解细胞%每孔加入 ."$B@的胰蛋白酶 ."B
2F% 置 5%A$B@ 8C$ 恒温培养箱中充分消化后加
入无菌三蒸水 ."B 2F%反复吹打%镜下不见完整细
胞 时 % 用 荧 光 分 光 光 度 仪 测 定 *677 细 胞 和
*6778 细胞内光敏剂的荧光强度值! 吸收时间检
测组&另外 5. 组 *677 细胞及 *6778 细胞在避光
条 件 下 更 换 为 不 含 胎 牛 血 清 的 &!’’ 液 配 制 的
9:;<;=>?1-!% 光 敏 剂 终 浓 度 分 别 为 5. "H E 2F$!B
"H E 2F$!. "H E 2F’根据吸收浓度检测组的数据(%
置 于 5%A$B@ 8C$ 恒 温 培 养 箱 中 分 别 培 养 .$!B$
5.$G.$’.$!$.$!B.$!0.$$!.$$#. 2?1 后% 取 出 培
养板%用 ()* 冲洗 5 遍! 采用胰蛋白酶消化及低渗
液裂解细胞%每孔加入 ."$B@的胰蛋白酶 ."B 2F%
置 5%A$B@ 8C$ 恒温培养箱中充分消化后加入无
菌三蒸水 ."B 2F% 反复吹打% 镜下不见完整细胞
时% 用荧光分光光度仪测定 *677 细胞和 *6778
细胞内光敏剂的荧光强度值!
!"#"# 细胞样品荧光强度值的测定 处理后的样
品直接在 I-5.!. 型荧光分光光度仪上测定其荧光
强度值%测定条件为&激发 波 长 5’B 12%发 射 波 长
G5#"! 12%灵 敏 度J."! 12%夹 缝 5"5 12%由 显 示 器
直接读出最大荧光强度值) 每组取 5 孔平均值表
示 *677 及 *6778 细胞光敏剂 9:;<;=>?1-!含量!
!"# $%&’&()*+,!的排出实验
*677 细 胞 及 *6778 细 胞 培 养 方 法 同 实 验
!"#"5! 分别取对数生长期的 *677 细胞及 *6778
细胞%."$B@胰蛋白酶液消化% 配成 !".D!.B 个 E 2F
的细胞悬液%接种于 G 孔细胞培养板%每孔 ! 2F! 置
于 5%A$B@ 8C$ 孵育箱中继续培养 $# :%将细胞随
机分成 $! 组%每组 5 复孔%()* 液冲洗 5 遍后%在避
光 条 件 下 更 换 为 不 含 胎 牛 血 清 的 &!’’ 液 配 制 的
9:;<;=>?1-!% 光 敏 剂 终 浓 度 分 别 为 !. "H E 2F$!B
"H E 2F$5. "H E 2F% 置于 5%A$B@ 8C$ 恒温培养箱
中 继 续 孵 育 !B. 2?1% 然 后 弃 去 含 9:;<;=>?1-!的
&!’’ 液%()* 冲洗 5 遍后%更换为不含 (:;<;=>?1-!
的 &!’’ 液% 分别于 . 2?1$!B 2?1$5. 2?1$#B 2?1$
G. 2?1$’. 2?1$!$. 2?1 采用胰蛋白酶消化及低渗
液裂解细胞%每孔加入 ."$B@的胰蛋白酶 ."B 2F%置
5%A$B@ 8C$ 恒温培养箱中充分消化后加入无菌三
蒸水 ."B 2F%反复吹打%镜下不见完整细胞时%用荧
光分光光度仪测定 *677 细胞和 *6778 细胞内光
敏剂的荧光强度值%测定方法同 !"#"#!
!"- 统计学分析
实 验 数 据 均 用 均 数J标 准 差’!"K(表 示%采 用
*(**!.". 统计软件包单因变量方差分析的方法对
组 间 和 组 内 数 据 分 别 分 析%#$.".B 为 差 异 有 统 计
学意义!
. 结 果
."! $%&’&()*+,!的 荧 光 激 发 光 谱 和 荧 光 发 射 光
谱
用 $$’ 12$$0. 12$5’B 12 等波长光照射时%
均能激发 9:;<;=>?1-!产生荧光% 其中最大荧光激
发 波 长 为 ’5’B".J."B(12% 最 大 荧 光 发 射 波 长 为
’G5#"!J."B(12’图 !(!
.". 培养用液的吸收光谱
在 +,-$$.! 型紫外可见光分光光度仪上检测
对波长为 $$./0.. 12 光的透射率%手动扫描结果
显示&()* 缓冲液$&!’’ 完全培养液$ 不含血清的
&!’’ 培 养 液 以 及 细 胞 培 养 过 程 中 收 集 的 残 余 培
养 基 透 光 率 在 G.. 12 光 照 射 后 透 光 率 均 达 到
!..@’图 $(! 这说明本研究所用光敏剂 9:;<;=>?1-
!所需要的 G5. 12 激发波长的光% 可完全通过细
胞培养液!
高社干!等" 食管癌细胞系对光敏剂 9:;<;=>?1-!的吸收和排出研究!"#$
C M Y K
图 ! "#$%$&’()*!的荧光光谱
+(,-’. / 01. 23-$’.45.)5. 4".5%’-6 $2 "1$%$4.)4(%(7.’
"1$%$2’()*!
图 8 细胞培养液的吸收光谱
+(,-’. 8 01. 9:4$’"%($) 4".5%’-6 $2 5.33 5-3%-’. 23-(;
<.2$’. %’="4()(79%($) >2%.’ %’="4()(79%($) >2%.’ ()5-:9%($) ?(%1 "1$%$2’()*!
图 @ 倒置显微镜下 ABCD 细胞与 "1$%$2’()*!孵育 !EF 6() 前后的形态
+(,-’. G H$’"1$3$,= $2 ABDD 5.334 :.2$’. 9); 92%.’ !EF 6() $2 ()5-:9%($) ?(%1 "1$%$2’()*! $:4.’I.; -);.’ ()I.’%.;
6(5’$45$"= !JKFF"
L.2$’. %’="4()(79%($) M2%.’ %’="4()(79%($) M2%.’ ()5-:9%($) ?(%1 "1$%$2’()*!
图 K 倒置显微镜下 ABDDN 细胞与 "1$%$2’()*!孵育 /EF 6() 前后的形态
+(,-’. K H$’"1$3$,= $2 ABDDN 5.334 :.2$’. 9); 92%.’ /EF 6() $2 ()5-:9%($) ?(%1 "1$%$2’()*!$:4.’I.; -);.’ ()I.’%.;
6(5’$45$"= !JKFF"
高社干!等O 食管癌细胞系对光敏剂 "1$%$2’()*!的吸收和排出研究
!"# $%&& 细 胞 及 $%&&’ 细 胞 对 光 敏 剂
()*+*,-./0!的吸收
POGO! 吸收浓度检测组 ABDD 细胞及 ABDDN 细
胞 用 胰 蛋 白 酶 消 化 前 后 及 与 "1$%$2’()*!孵 育 !EF
6() 后的细胞形态见图 G# 图 K$ 将 ABDD 细胞及
ABDDN 细 胞 用 不 同 浓 度 的 "1$%$2’()*!孵 育 !PF
6() 后%其荧光强度值见表 !$ 与 "1$%$2’()*!共同
孵 育 !PF 6() 后 %ABDD 细 胞 和 ABDDN 细 胞 对
!"#!
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7289:1301;01 <;=1;3<=>69;01;=:?=<9; 9@
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表 ! "#$$ 细胞和 "%$$& 细胞与不同浓度 ’()*)+,-./!
孵育 012 3-. 后的荧光强度值
45678 0 4(8 +79),8:;8.;8 -.*8.:-*< )+ "%$$ 5.= "%$$&
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表 > 与不同浓度 ’()*)+,-./!孵育不同时间后 "%$$ 细胞和 "%$$& 细胞内的荧光强度值
45678 > 4(8 +79),8:;8.;8 -.*8.:-*< )+ "%$$ 5.= "%$$& ;877: 5+*8, -.;965*-). ?-*( 02! 0A! 5.= B2 "C D 3E
’()*):8.:-*-@8, ’()*)+,-./!
高社干!等4 食管癌细胞系对光敏剂 AB9=9@:<;C!的吸收和排出研究
AB9=9@:<;C!的吸收量差异无统计学意义!!J%4#’*#
"J&4#),"$ -.// 细胞和 -.//6 细胞对 AB9=9@:<;C!
的吸收量均随浓度的增加呈逐渐增加的趋势 !组
内比较 !J#)4"*+#"J&4&&&"# 到 ’& "D E FG 后进入
平台期$ ’& "D E FG 处理组与低于 %& "D E FG 的各
处理组比较#其差异均有统计学意义!"J&4&&&#"J
&4&&&#"J&4&&+#"J&4&(,"%而后各组比较其差 异 无
统 计 学 意 义!"J&4,,+#"J&4+(’#"J&4")##"J&4%#"#
"J&4#*(#"J&4%((#"J&4#(""$
%4’4% 吸收时间检测组 将光敏剂终浓度分别设
为 #&&#"&’& "D E FG#观察 -.// 细胞和 -.//6 细
胞对 AB9=9@:<;C!的吸收时间峰值#结果显示 -.//
细 胞 和 -.//6 细 胞 对 KB9=9@:<;C!的 吸 收 特 性 比
较差异均无统计学意义!"L&4&""#见表 %$ 随着孵
育时间的延长# 两组细胞对 AB9=9@:<;C!吸收量均
呈增高趋势!组内比较 " J&4&&&"##"& F<; 后进入
平 台 期 $ 统 计 分 析 结 果 显 示 # 孵 育 #"& F<; 后
-.// 细 胞 和 -.//6 细 胞 内 荧 光 强 度 值 与 #"&
F<;前比较差异均 有 统 计 学 意 义 !"M&4&#"# 而 与
#"& F<; 后 不 同 孵 育 时 间 点 比 较 差 异 无 统 计 学 意
义!"L&4&""$
!"# $%&’&()*+,!在 -.// 细 胞 及 -.//0 细 胞
中的排出
-.// 细胞和 -.//6 细胞在 ’ 种 KB9=9@:<;C!
浓度条件下孵育 #"& F<; 后#换用不含KB9=9@:<;C!
的 N$,, 培 养 液#并 观 察 其 排 泄 #结 果 表 明 -.//
细 胞 和 -.//6 细 胞 对 KB9=9@:<;C!的 排 泄 特 性 比
较差异均无 统 计 学 意 义!"L!4!""#见 表 ’%两 组 细
胞 内 KB9=9@:<;C!含 量 均 呈 下 降 趋 势#其 浓 度 分 别
为 $! "D E FG 和 $" "D E FG 时#’! F<; 内AB9=9@:<;C!
在 -.// 细胞和 -.//6 细胞内可保 持 较 高 水 平 #
’! F<; 前 各 时 相 点 比 较 均 无 统 计 学 意 义 !"L
! 4 !" " # 但 ’! F<; 以 后 -.// 细 胞 和 -.//6 细
胞 对 AB9=9@:<; C! 的 排 出 迅 速 增 加 % 浓 度 ’!
"D E FG 条 件 下 #$" F<; 前 各 时 相 点 比 较 均 无
统 计 学 意 义 !"L! 4 !" " # 但 $" F<; 以 后 -.//
细 胞 和 -.//6 细 胞 对 AB9=9@:<; C!的 排 出 迅 速
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