结直肠肿瘤中TEIF基因的表达及其与中心体改变的关系.pdf
结直肠肿瘤中TEIF基因的表达及其与中心体改变的关系.pdf
!癌症" !"#$%&% ’()*$+, (- .+$/%*# 0112# 03$40%&506675030
!基础研究!
58 北京大学医学部病理学系"
北京 499525
08 北京世纪坛医院病理科"
北京 5999:3
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通讯作者!张 波
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A%,8# 3B84983039004C
D+E# 3B84983039004C
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收稿日期!0112L1:L:5
修回日期!0112L1BL0C
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"摘 要 # 背 景 与 目 的 !AFMN 基 因 是 本 室 新 近 发 现 的 一 种 调 节 端 粒 酶 "AFOA
基 因 表 达 的 转 录 因 子&在 多 种 肿 瘤 组 织 中 均 有 表 达( 本 研 究 观 察 AFMD 基 因 在 结
直 肠 肿 瘤 组 织 中 的 表 达 及 其 与 中 心 体 改 变 的 关 系( 方 法!通 过 原 核 表 达 AFMD 蛋
白 免 疫 制 备 多 克 隆 抗 体 &经 免 疫 印 迹 鉴 定 后 &对 59 例 结 直 肠 黏 膜 正 常 组 织 ):9
结直肠肿瘤中 <=>? 基因的表达及其
与中心体改变的关系
高 颖 5"0" 张 波 5
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2$# ’+%%17&$2+- ;2$5 ’1-$%+#+C1 &"-+%C&72$:
Q-+0 P*$I&R *+6 S$ T9’+0I
!"##
C M Y K
结直肠肿瘤是最常见的消化道肿瘤之一!占消
化道肿瘤的第二位"近年来随着在分子水平上对结
直 肠 肿 瘤 发 病 机 制 研 究 的 不 断 深 入!人 们 逐 渐 认
识 到!结直肠肿瘤发生时包括腺瘤性结直肠息肉病
#!"#$基 因%$%& 基 因%’()*+ 基 因 等 多 基 因 共 同 从
分子水平上调控细胞的增殖%凋亡等过程!从而导
致肿瘤的形成&,!-’(
中 心 体 #./01)2+23/$ 也 叫 微 管 组 织 中 心
#34.)215657/ 2)8*049408 ./01/)! :;<#$) 几 乎 所 有
的人类非整倍体肿瘤中均有中心体异常 &&’"
;=>? *1/723/)*+/ 1)*0+.)4$1420*7 /7/3/01+(
401/)*.1408 @*.12)$基因是本研究室克隆的调节端粒
酶 A;=B; 基因表达的转录因子 &C’) 研究表明 ;=>?
在多种肿瘤组织高表达!并与肿瘤*肉瘤$的组织分
级或恶性度有关 &%’) 最近的研究表明!;=>? 基因定
位于中心体&D’!而中心体的异常可以直接导致肿瘤
的发生) 这些发现提示 ;=>? 与人肿瘤的发生密切
相关! 而端粒失能及 EFG 损伤后导致 ;=>? 向 中
心体移动!同时引起中心体扩增) 本研究通过制备
特异多克隆抗体来检测人结直肠肿瘤 *包括结直
肠癌及结直肠腺瘤$ 组织中 ;=>? 基因的表达!并
通过免疫荧光的方法对结直肠肿瘤中心体的表达
进行检测!从而探讨结直肠肿瘤中 ;=>? 基因的表
达与中心体改变的关系)
! 资料与方法
!"! 组织标本来源及一般病例资料
采 用 回 顾 性 研 究 方 法 ) 病 例 取 自 北 京 世 纪
坛 医 院 -HH%I-HHJ 年 手 术 切 除 及 活 检 病 例 存 档
蜡 块 ! 并 根 据 -HH- 年 KL< 结 直 肠 肿 瘤 分 类 进
行 病 理 学 诊 断 和 免 疫 组 织 化 学 鉴 定 ) 结 直 肠 癌
&H 例 !其 中 男 性 ,D 例 !女 性 ,C 例 +年 龄 C&MJ%
岁!中 位 年 龄 D& 岁) 病 理 类 型 主 要 有 ,结 直 肠 高
分 化 腺 癌 % 例 -结 直 肠 中 分 化 腺 癌 ,N 例 %结 直
肠 低 分 化 腺 癌 J 例 +结 直 肠 腺 瘤 , 级 ,J 例 *包
括 管 状 腺 瘤 ,J 例 $!其 中 男 性 ,& 例 !女 性 % 例 !
年 龄 CNMJ& 岁 !中 位 年 龄 DNO% 岁 +结 直 肠 腺 瘤 -
级 ,N 例 *包 括 管 状 腺 瘤 & 例 +绒 毛 状 腺 瘤 , 例 +
绒 毛 状 管 状 腺 瘤 ,& 例 $!其 中 男 性 P 例 !女 性 J
例 !年 龄 %-MJ- 岁 !中 位 年 龄 DJ 岁 +结 直 肠 腺 瘤
& 级 ,P 例 *包 括 管 状 腺 瘤 - 例 + 绒 毛 状 腺 瘤 &
例 +绒 毛 状 管 状 腺 瘤 ,C 例 $!其 中 男 性 ,H 例 !女
性 P 例 !年 龄 -NMJC 岁 !中 位 年 龄 NH 岁 !其 中 包
括 腺 瘤 局 部 恶 变 病 例 D 例 ) 正 常 肠 黏 膜 组 织 ,H
例 !其 中 男 性 D 例 !女 性 C 例 !年 龄 CNMNN 岁 !中
位 年 龄 NC 岁 )
!"# 免疫血清制备
参 见 文 献&D’所 述!将 纯 化 的 ;=>? 融 合 蛋 白
免疫雄性新西兰 白 兔) 初 次 免 疫,, 38 融 合 蛋 白
与等体积完全弗氏佐剂充分乳化后于兔背部皮下
多点注射) 加强 免 疫,, 38 融 合 蛋 白 与 等 体 积 不
完 全 弗 氏 佐 剂 乳 化 !部 位 同 上+于 ,C Q 后 重 复 加
强免疫 , 次!剂量%部位同上)初次免疫后第 %D 天
经颈动脉取血!分离血清!分装并冻存于I-HR)免
疫前取耳静脉血清!作为对照)
!"$ %&’(&)* 印迹分析
硝酸纤维素膜上!经脱脂奶粉封闭后!用制备
兔血清*,. - HHH$ &NR , A 结合),S磷酸缓冲液洗涤
后!生物素化羊抗兔 >8T*,. %HH$室温 , A!加链卵白
素I碱性磷酸酶*,. %HH$室温 , A 结合!FU;(UV>" 显
色) 免疫前兔血清作阴性对照)
!"+ 免疫组织化学
组织切片依次经二甲苯脱蜡- 梯度乙醇水化
后 !于 HO&W过 氧 化 氢 室 温 , A 处 理 !柠 檬 酸 缓
冲 液 于 微 波 P%R -H 340 抗 原 修 复 ) 牛 血 清 白 蛋
白 *-W $ 室 温 封 闭 , A 后 ! 滴 加 抗 ;=>? 血 清
例 结 直 肠 癌 和 %C 例 结 直 肠 腺 瘤 *!级 ,J 例 !"级 ,N 例 !
#级 ,P 例$标 本 行 ;=>? 蛋 白 免 疫 组 化 检 测 及 $(1565740 免
疫 荧 光 染 色 检 测) 结 果!免 疫 组 化 结 果 显 示 正 常 组 中 ;=>?
蛋 白 的 表 达 率 *,HOHW$与 肿 瘤 各 组 之 间 *恶 性 肿 瘤 组 表 达
率 ,HHW! 良 性 肿 瘤 组 PJO,W$ 的 差 异 有 统 计 学 意 义 *!X
HOH,$! 恶 性 肿 瘤 组 与 良 性 肿 瘤 组 之 间 的 差 异 无 统 计 学 意
义*!YHOH%$)癌 组 织 组 中 ;=>? 强 阳 性 率*!ZZ$*,HHW$均
显 著 高 于 腺 瘤 组 *D,O,W$及 正 常 组 *HW$*均 为 !XHOHH,$+
腺 瘤!级 *,,O,W$与 腺 瘤"级 *NDO%W$及#级 *PCONW$组
织 中 ;=>? 强 阳 性 率 之 间 的 差 异 有 统 计 学 意 义 *!XHOH%$!
而 腺 瘤#级 与 腺 瘤"级 间 的 差 异 无 统 计 学 意 义 *!YHOH%$)
免 疫 荧 光 结 果 显 示 结 直 肠 癌 组 中 心 体 扩 增 阳 性 率 *,HHW$
显 著 高 于 正 常 组 *H$及 腺 瘤 组 *DCOJW$*均 为 !XHOH,$+腺
瘤!级*CCOCW$与 腺 瘤#级 *NPOHW$中 心 体 扩 增 阳 性 率 之
间 的 差 异 有 统 计 学 意 义*!XHOH%$!而 腺 瘤!级 与 腺 瘤"级
*NHODW$-腺 瘤"级 与 腺 瘤#级 之 间 的 差 异 无 统 计 学 意 义
*!YHOH%$) 结 论!;=>? 蛋 白 及 中 心 体 扩 增 常 见 于 结 直 肠 肿
瘤 中! 其 表 达 水 平 与 肿 瘤 的 组 织 学 分 级 及 恶 性 程 度 相 关 )
;=>? 蛋 白 表 达 与 中 心 体 扩 增 呈 高 度 的 正 相 关)
关键词! 结直肠肿瘤+;=>?+基因表达+中心体
中图分类号!BN&% 文献标识码!!
文章编号!,HHHICDN[*-HHP$,-I,-NNIHD
高 颖!等O 结直肠肿瘤中 ;=>? 基因的表达及其与中心体改变的关系!"#$
C M Y K
!!" ! "###于 室 温 ! $$洗 涤 后 加 %&’()(*& 抗 兔 抗
体%+,-. 公司&室温 /# 0(&$+,1 显色$苏木精复
染’中性树胶封片( 阴性对照)免疫前兔血清及 !2
314 代替第一抗体*
结 果 判 断) 在 阴 性 对 照 无 着 色 时$5%67 阳 性
主要为结直肠腺体细胞核呈棕黄色* 根据肿瘤细
胞着色的比例对组织进行阳性强度分级) 无着色
或阳性细胞 8"9为:+ "9;"#9细胞阳性$一般强
度为 <+ ="#9;>#9细胞阳性$强阳性着色 为<<+
=>#9细胞$超强阳性着色为<<<*
!"# 免疫荧光
组 织 切 片 依 次 经 二 甲 苯 脱 蜡 , 梯 度 乙 醇 水
化 后 $于 #?/9过 氧 化 氢 室 温 ! $ 处 理 $柠 檬 酸
缓 冲 液 于 微 波 @"A B# 0(& 抗 原 修 复* 牛 血 清 白
蛋 白 !B9 &室 温 封 闭 ! $ 后 $滴 加 一 抗 !CDEFEG(&
!!" B ###&!购自 4H&DH IJEK 公司& 于室温 ! $$洗
涤后加标记有 5L65I 的抗山羊抗体 6MN 二抗 !中
杉公司&室温 /# 0(&$+,36 复染核$甘油封片* 阴
性对照)用免疫前血清及 !2314 代替第一抗体*
结果判断) 在荧光显微镜下 LO.+ 通道及紫
外通道下观察$阴性对照无着色时$中心体扩增阳
性主要为细胞核周围有 B 个或 B 个以上红色点状
或块状荧光*
!"$ 统计学分析
数 据 采 用 4344!/?# 统 计 分 析 软 件 进 行 分 析*
结 直 肠 正 常 黏 膜 组 ’ 腺 瘤 组 及 结 直 肠 癌 组 之 间
5%67 表 达 异 常 及 中 心 体 异 常 的 差 异 采 用 B2B 列
联表 "B 检验分析* 5%67 表达异常与中心体异常之
间的关系采用相关性分析* !8#?#" 为有统计学意
义*
% 结 果
%"! 结直肠肿瘤中 &’() 蛋白的表达
5%67 免 疫 组 化 阳 性 为 细 胞 核 着 色$部 分 病 例
伴有核周着色* 大多数病例呈肿瘤细胞弥漫性阳
性分布!图 !&* 免疫组化结果见表 !* 对 / 组病例
的 5%67 阳性率进行统计$结果显示在结直肠正常
黏膜组与肿瘤各组之间阳性率的差异有统计学意
义!均为 !8#?##!&$而恶性肿瘤与良性肿瘤之间的
差异无统计学意义!! =#?#"&*
I,
+
1
% 7
图 ! 免疫组化染色检测人结直肠肿瘤组织 5%67 蛋白表达 !%&’()(*& 2B##"
7(MEJP ! %QRJP))(*& *S DPG*0PJH)P DJH&)TJ(RD(*&HG PGP0P&D)C(&DPJHTD(&M SHTD*J !5%67& (& $E0H& T*G*JPTDHG DE0*J D())EP)
!%&’()(*& 2B##&
3*)(D(UP PQRJP))(*& G*THDPV (& D$P &ETGP( () FJ*W&? ,$ HVP&*0H *S NJHVP ! !< &+ 1$ HVP&*0H *S NJHVP B !<< &+ I$ HVP&*0H *S NJHVP /
!<<< &+ +$ WPGGCV(SSPJP&D(HDPV HVP&*THJT(&*0H !<<< &+ %$ 0*VPJHDPGXCV(SSPJP&D(HDPV HVP&*THJT(&*0H !<<< &+ 7$ R**JGXCV(SSPJP&D(HDPV
HVP&*THJT(&*0H !<<<&?
高 颖!等? 结直肠肿瘤中 5%67 基因的表达及其与中心体改变的关系 !"#$
C M Y K
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图 ; 免疫荧光染色检测人结直肠肿瘤组织中 !3#1=1%/* 蛋白表达!免疫荧光 M: >>>"
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高 颖!等E 结直肠肿瘤中 UKVL 基因的表达及其与中心体改变的关系
!"! #$%& 蛋白表达强度与结直肠肿瘤类型的关系
各 级 别 腺 瘤 及 癌 组 织 中 UKVL 蛋 白 的 阳 性 表
达强度见表 :% UKVL 蛋白表达在正常组与结直肠腺
瘤组及结直肠癌组之间的差异均有统计学意义!均
为 !W>E>:"% 癌组织组中 UKVL 强阳性率均显著高于
腺瘤组!均为 !W>E>:"$腺瘤 : 级与腺瘤 ; 级&< 级之
间的差异有统计学意义!!W>E>?"#但腺瘤 < 级与腺
瘤 ; 级之间的差异无统计学意义!!X>E>?"%
表 ! 各组结直肠组织中 "#$% 蛋白阳性率及表达强度
"&’() ! *+,-.-/) 0&.), &12 ()/)(, +3 .0&1,40-5.-+1&( )()6)1.,7-1.)0&4.-18 3&4.+0!"#$%" )950),,-+1 -1 /&0-+:, .;5), +3
4+(+0)4.&( .-,,:),
UKVL ’*1-=(’ !Y"(
8’"1P U6P(
肠癌组 UKVL 蛋白强阳性表达结果显示) 高分
化腺癌与中分化腺癌& 低分化腺癌 UKVL 超强表达
率 差 异 有 统 计 学 意 义!均 为 !W>E>?"#而 后 两 者 之
间的差异无统计学意义!!X>E>?"%
!"’ 中心体扩增检测
荧光显微镜下可见细胞核周围有红色点状荧
光!图 ;"% 在结直肠癌组织中可见大多数肿瘤细胞
核周围大于 ; 个红色点状荧光及块状荧光#提示在
!"#$
C M Y K
高 颖!等! 结直肠肿瘤中 "#$% 基因的表达及其与中心体改变的关系
这些细胞中 !&’()(*+, 蛋白异常表达!即在这些细胞
中中心体出现异常扩增" 结直肠癌组中心体扩增阳
性率显著高于正常肠黏膜及腺瘤组#均为 !-./.0$%
腺瘤 0 级与腺瘤 1 级之间的差异有统计学意义#!2
./.3$!而腺瘤 0 级与腺瘤 4 级&腺瘤 4 级与腺瘤 1
级之间的差异无统计学意义#!5./.3$!见表 4’
表 ! 结直肠组织中中心体扩增检测
"#$%& ! ’&()*+,+-& #-.%/0/1#)/+( /( 1+%+*&1)#% )/,,2&,
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F96(O "DO:
!"# 中心体扩增与结直肠癌类型的关系
在肠癌组中!高分化肠癌组织中中心体扩增阳
性率为 0..K#3 P 3$!强阳性率为 .K#. Q 3$* 在中分
化 肠 癌 组 织 中 !&’()(*+, 阳 性 率 为 0..K#0G Q 0G$!
强阳性率为 GM!3K#01 Q 0G$! 超强阳性率为 4I!LK
#3 Q 0G$* 在低分化肠癌组织中 !&’()(*+, 阳性率为
0..K#H Q H$!超强阳性率为 HG!3K#G Q H$* 即随着肿
瘤分化程度的降低!其中心体扩增强阳性率呈现增
高的现象*
!"$ %&’( 蛋 白 表 达 强 度 与 中 心 体 异 常 扩 增 的 相
关性
"R$% 蛋白及中心体扩增呈显著的线性相关性
#"S.!M4H!!2.!..0$!详见表 1*
) 讨 论
"R$% 蛋 白 为 新 近 克 隆 的 调 节 端 粒 酶 T"RU"
基因表达的转录因子! 它通过与 T"RU" 上游调节
区特异结合!激活内源性 T"RU" >U?< 表 达 水 平
和 端 粒 酶 活 性* 并 且 在 前 期 研 究 结 果 显 示 !"R$%
基因的表达与端粒酶活性一致! 而降低其表达则
显著抑制癌细胞生长和恶性表型 (LVG)* 本研究结果
显示结直肠癌中 "R$% 蛋白表达率高!结合先前的
研究结果!有理由推测 "R$% 在结直肠良性病变的
早期就出现异常! 并与结直肠肿瘤发生中的端粒
酶 激 活 或 生 物 学 特 性 有 一 定 关 系 * 有 研 究 证 明
"R$% 蛋白 8V末端定位于中心体! 提示不仅 "R$%
参与端粒酶活 性 调 节!其 基 因 产 物 还 可 能 作 为 重
要 的 中 心 体 调 节 蛋 白!参 与 对 端 粒 异 常 诱 导 的 中
心体反应调节 (H)* "R$% 蛋白表达在结直肠癌高表
达! 显著高于各级别的结直肠腺瘤及正常的黏膜
组织%同时!在结直肠腺瘤 1 级并局部恶性变的病
例中 "R$% 蛋白表达明显高于腺瘤 0 级!这也表明
"R$% 蛋白在结直肠肿瘤恶性变过程中可能是其恶
性 转 变 的 标 志 物!"R$% 蛋 白 表 达 有 可 能 成 为 结 直
肠肿瘤特别是结直肠腺瘤恶变的标志物而用于鉴
别诊断* 本研究通过检测 "R$% 蛋白在结直肠肿瘤
组织中的表达! 初步显示其在结直肠肿瘤组织中
的高表达!也提示 "R$% 可能成为结直肠肿瘤的治
疗靶点*
最近的研究表明!在许多其他肿瘤#如膀胱癌+
软组织肿瘤等$中均有中心体的扩增(I!0.)"中心体缺
陷还可以增加其他肿瘤相关基因进一步发生遗传
改变的可能性! 进而影响肿瘤的发展(4)" 本研究结
果显示在结直肠癌组织中!中心体异常显著高于结
直 肠 各 级 别 腺 瘤 ,0 级&4 级&1 级 分 别 为 LL!LK&
表 3 肿瘤组织中 "456 蛋白表达强度与中心体扩增的关系
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