白细胞介素-18对Lewis肺癌小鼠肿瘤增殖及微血管生成的抑制作用.pdf
白细胞介素-18对Lewis肺癌小鼠肿瘤增殖及微血管生成的抑制作用.pdf
中国癌症杂志
CHINA ONCOLOGY
2009年第19卷第 1期
2009 Vo1．19 No．1 17
白细胞介素一1 8对Lewis肺癌小鼠肿瘤
增殖及微血管生成的抑制作用
[摘要] 背景与目的：白细胞介素18(interleukinl8，IL一18)是新近发现的一种多效能细胞因子，在
抗肿瘤、免疫调节等方面有着积极的作用及潜在广阔的应用前景。本文旨在研究IL—l8对Lewi s肺癌小鼠肿瘤增
殖及微血管生成的抑制作用。方法：复~Lewi s肺癌小鼠模型l6只，随机均分为IL—l8治疗组 (A组)与荷瘤模
型组 (B组)，分别于接种第7天起子IL一18、0．9％氯化钠溶液腹腔注射，每日lbk，连续7次。观察Lewis肺癌小
鼠健康状况，监测皮下移植瘤变化，并用免疫组化法检测肿瘤增殖细胞核抗原 (proliferating ce]1 nuclear
antigen，PCNA)与微血管密度 (microvessel density，MVD)表达水平。结果：IL一18对小鼠健康状况无明显
影响，但可明显抑制移植瘤生长，抑瘤率为75％，并显著降低肿瘤PCNA表达与MVD水平，IL～l8治疗组与荷瘤模
型组该两项指标比较，差异均有统计学意义 (尸<0．01)。 结论：IL一18可抗Lewi s肺癌生长，其作用与抑制肿
瘤增殖活性及微血管生成相关。
[关键词] IL—l8； 肺癌； 增殖； 微血管密度
中图分类号：R73—36 1 文献标识码 ：A 文章编号：1007—3639(2009)01～0017—04
Inhibition effect of IL-1 8 on proliferation of tumor cells and angiogenesis in C57BL／6 mice Lewis
lung cancer CHEN Xiang—qi，LIN Ting-yan LI Zhi-ying．YANG Sheng。LU Hui—shan．KANG
／fling～qiang (Department of Respiratory Diseases,the Union Hospital of fujian Medica
University，Fuzhou Fujian 350001，China)
Correspondenco to：LIN Ting—yan E-mail：tingyanlin~yahoo COm．cn
LAbstract] Background and purpose：IL一18 is one of the latest discoveries of pleiotropic cytokine
．
which can play an active role in antitumor and immunoregulation
， and there might be a variety of potentialities of its
application．This study was to investigate the inhibition efect of IL．1 8 on proliferation and angiogenesis of tumor cells
in C57BL／6 mice Lewis lung cancer
． M ethods：C57BL／6 mice engrafted with Lewis lung cancer was used as anima1
model，The expression level of proliferating cel nuclear antigen(PCNA)and microvessel density(MVD)in tumor mass
were measured by imunohistochemistry staining(IHCS)．Results：IL．1 8 could obviously inhibit the growth of tumor
cells and decelerate the proliferation of tumor cells by 75％
， and reduce the expression of PCNA and MVD[(1 6~4)VS
(25~4)】in the xenografts but not in normal animals．Conclusion：IL．18 could inhibit tumor growth in C57BL／6 mice
Lewis lung cancer model，down regulate proliferating activity of tumor cels，and its inhibition of angiogenesis may be
one its important mechanisms．
[Key words] IL．18；Lung cancer；proliferation；MVD
肺癌是当今世界上发病率和病
恶性肿瘤 ，且近年来呈上升趋势
则低T3％ 。造成其死亡率
， 其中重要因素之一是现有的
疗条件不断提高，传统的治疗方法如手术、 治疗手段对中晚期患者的疗效仍较差。在过去
疗 、放疗等不断改进 ，然而非小细胞肺癌 的30年中，免疫学的巨大进展，促进了细胞工
non—smal cel lung cancer，NSCLC)5年生存 程、基因工程等生物技术的发展和应用，抗肿
仅在1O％左右，小细胞肺癌 (smal ce11 lung 瘤活性的生物制剂，如细胞因子、分子疫苗等
的产生及应用，已得到临床证实。免疫治疗作
蔗金粤旦： 建省卫生厅青年科研课题立项(2005—2—29)；福建省自然科学基金计划资助项目(2006J0342)。 通讯作者
： 林挺岩 E．mail：tingyanlin@yahoo．corn．ca
盯原
∽的
∞高
高 然
最 虽
率 。 死 ̈
的 医 化 率
陈湘琦，等． 白细胞介素一18对Lewis肺癌小鼠肿瘤增殖及微血管生成的抑制作用
为肿瘤治疗的第4种模式，已积极尝试用于肿
瘤的临床治疗。白细胞介素一18(IL一18)是新
近发现的一种细胞因子，能诱导IFN一 的产
生，增强由Fas配体介导的NK细胞、T2m胞和骨
髓单核细胞的细胞毒活性，具有显著的抗肿瘤
能力，但其在肺癌实验动物模型中的研究国内
尚少见报道 J。本实验采用Lewis肺癌细胞建
立C57BL／6d~鼠移植瘤模型，研究IL—l 8对Lewis
肺癌增殖及微血管生成的抑制作用。
1 材料和方法
1．1 材料 雄性C57BL／6~鼠16只，6N]龄，
体重 (20±2)g，购自上海斯莱克实验动物有
限公司。Lewis肺癌细胞株由福建医科大学药学
院赠予。IL一18购自上海晶美公司，美NlSigma
公司生产。增殖细胞核抗原(PCNA)、Ⅷ因子相
关抗原(Ⅷ一RAg)抗体和MaxVision免疫组化试剂
盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1．2 方法
1．2．1 Lewis肺癌模型的建立 C57BL／6d~鼠
在SPF条件下繁殖、饲养，将常规复苏后的肿
瘤细胞接种于小鼠右腋部皮下，当移植瘤生长
至直径2．0 cm左右时，选择肿瘤生长旺盛，且
动物一般状况良好的荷瘤鼠，颈椎脱臼处死，消
毒、切开皮肤，剖取肿瘤组织，用0．9％氯化钠
溶液以1：5的比例制备成细胞悬液，将Lewisn~
癌单细胞悬液调整为2×10 个／ml，于小鼠右腋
部皮下接种0．1 mIEN胞悬液，密切观察肿瘤生
长。
1．2．2 实验动物分组与处理 C57BL／6d~鼠接
种后随机分为IL一1 8治疗组 (A组 )与荷瘤模型
组 (B组 )，每组8只，于接种第7天起IL一18治
疗组每日1次给予IL一18(1 g／1O0 1)，荷
瘤模型组每日1次腹腔注射0．9％氯化钠溶液100
l，连续7次。观察实验期间小鼠进食、排
便、精神状态及活动情况。于接种后第7、9、
11、13、15、17、19天应用游标卡尺 (精度为
0．1 mm)测量并记录小鼠皮下瘤结节大小，计
算肿瘤体积，V(mm )=0．52ab (aN瘤体最
长径，b为最短径 )，取每组均数，制作肿瘤
生长曲线。于接种后第19天，统一以10％水合
氯醛3 ml／kg麻醉小鼠，剥离皮下瘤，称瘤重，
计算肿瘤抑制率，以常规10％中性甲醛固定，
制成石蜡切片备用。肿瘤抑制率=[(荷瘤模
型组平均瘤重 一IL一18治疗组平均瘤重 )／荷瘤
模型组平均瘤重 ]×100％。
1．2．3 病理与免疫组化检查 肿瘤组织行常规
病理苏木精一伊红 (HE)染色，光镜下观察各
组肿瘤组织病理学变化特征。对病理切片进行
PCNA、WlI—RAg抗体免疫组织化学MaxVision
法检测 ，操作按试剂盒说明书进行。结果判
断：PCNA阳性表达为细胞核内棕黄细颗粒状
沉定，在400倍视野下随机选取5个癌细胞区，
每个视野计数200个癌细胞，计算阳性细胞占
细胞总数百分率。阳性细胞率<1％为 “一”，
1％～24％为 “+” ，25％～<50％为 “++” ，
50％一75％为 “+++”，>75％为 “++++”。微
血管密度 (MVD)计数按Weidner等方法：首
先用40倍或100倍光镜扫描整个切片寻找高血
管密度区，而后在400倍光镜下计数5个视野内
的微血管数目，取其平均数为MVD。微血管
计数标准为：凡与临近的肿瘤细胞、微血管或
结缔组织分开，呈棕黄色Ⅷ一RAg抗体染色的单
个内皮细胞、内皮细胞簇或血管于上的分支结
构，均作为一支血管，但肌层较厚或管腔面积
>8个红细胞直径的血管不计数。
1．3 统计处理 应用SAS统计分析软件，实验
数据采用Y-+-s表示，肿瘤平均体积比较采用重
复测量方差分析，肿瘤平均瘤重、MVD比较采
用成组t检验，PCNA采用秩和检验。当P<O．05
时，差异被认为具有统计学意义。
2 结 果
2．1 IL一1 8对小鼠一般状态的影响 实验期
间，各组小鼠健康状况均可，进食、排便、精
神及活动等都比较正常，小鼠对IL一18治疗的
耐受性较好，A组小鼠未见明显出血、腹泻及
其他药物不良反应，实验结束前各组小鼠无死
亡，均存活。
2．2 IL一1 8对小鼠肿瘤生长的影响 接种后
第7天全部小鼠成瘤，皮下结节直径均超过0．5
em，成瘤率100％。A组小鼠的肿瘤生长速度逐
渐减缓，明显受到抑制，B组小鼠的肿瘤生长
速度较快 ，生长曲线上升明显 (图1)。19 d
后A组与B组小鼠的肿瘤平均体积间差异有统
计学意义 (F=11．902，P<0．01)，A组与B组
小鼠的肿瘤平均瘤重之间差异亦有统计学意义
(t=4．195，P<0．01)，肿瘤抑制率为75％ (表
“中 国 癌 症 杂 志》 2 0 0 9 年第 1 9 卷第 l 期 1 9
谢
图 1 肿瘤 生 长 曲线
F ．g ．1 T u m o r g r o w t h c u r V e
表 1 第1 9 天 后各 组 间 小 鼠的肿瘤 平 均 体 积 、 瘤重 的 比较 及 肿瘤
抑 制 率
T h b ． 1 C O m p a r i s O n 0 f a V e r a g e t r a n s p l a n t a t i O n t u m o r V O l u m e ，
t u m o r w e i g h t a n d t u m o r i n h i b m O n r a t e i n t 、v O g r O u p s o n d a y
1 9 t h
2 ． 芎 病理 学 检 查 小 鼠肿 瘤 组 织 的 改 变 肉眼
观 察 ： A 组 肿 瘤组 织 较 小 ， 切 面 成 烂 鱼 肉样 ，
中央 可 见 液 化 坏 死 灶 ， 较 易 与周 围 肌 肉组 织 和
皮 肤 分 离 ； B 组 肿 瘤组 织 大 ， 质 脆 ， 不 易 与 周
围肌 肉组 织 和 皮肤 分离 。 H E 染 色光 镜 下 观 察 ，
A 组 小 鼠肿 瘤 细 胞 基 质 和 间质 减 少 ， 肿 瘤 细 胞
核 碎裂 、 溶 解 ， 可 见 较 广 泛 的 片状 、 条带状 坏
死 ， 部 分 为 均 质红 染 坏 死 组 织 ； B 组 小 鼠肿 瘤
细 胞 轮 廓清 晰 ， 但 大 小 不 等 ， 形 态 不 一 ， 散 在
分 布 ， 细胞 质 丰 富 ， 胞 核 大 而 深 染 ， 异 形 性 较
明显 ， 核 分 裂像较 多 见 ， 核质 比例增 大 ， 细 胞
{{}列紊舌L 。
2 ． 4 JL 一 1 8 对 小 鼠 肿 瘤 细 胞 P C N A 表 达 的影 响
免疫 组 化 染 色显 示 A 组 小 鼠肿 瘤组 织 中呈 深
棕色 的细 胞 核 明显 减 少 ， 染 色变浅 ， 阳性 细胞
均 为
“
+ ～ + +
”
( 图2 A ) ， B 组 小 鼠肿 瘤组 织 中
大 多 数瘤 细胞 的细 胞 核 呈 深 棕 色 ， 阳性 细胞 均
为
“
+ + ～ + + + +
”
( 图 2 B ) ， 两 组 比较 差 异有 统
计学 意 义 ( z = 2 ． 7 4 ， 尸< O． 0 1 ) 。
2 ． 5 l L 一 1 8 对 小 鼠 肿 瘤 组 织 M V D 水 平 的 影 响
免疫 组 化 染 色显 示 ： 镜下 肿瘤 组 织 切 片 中微
血 管 密 集 区 多 位 于 肿 瘤 细 胞 浸 润 前 缘 部 位 。
A 组 小 鼠肿 瘤 组 织 M V D 为 1 6 ± 4 ， B 组 小 鼠为
2 5 ± 4 ， 两 组 比较 差 异有 统计 学 意 义 ( 仨 4 ． 0 8 ，
P < 0 ． 0 1 。 见图3 A 、 B ) 。
骞遴一鬻惩
爹≯鬻j≤辫瀚
■
“
’
‘ ‘
，
-一
”
。
’
1、 √ 。 ． ．。 矗： j j 一；j ． ， ：0
， 一
．
0 ． ． ：，
‘
：j 1 0 0 _ r-- 0 ≯
‘
≯_
。
．0瀛蓉
蠢≯． ≯爹
：
j
’
；
i辫誊j鬟零
3 讨 论
P C N A 作 为 D N A 聚合酶 8 的辅 助 因 子 ，不 仅
在 D N A 复 制 中起 关键 作 用 ， 而 且 来 自细 胞 外
的增 殖 信号 都须 经 过 P c N A 的 参 与 ， 才 能 引 发
D N A 合 成 ， 细 胞 才能存活 和 增 殖 。 研 究 显 示 在
整 个 细 胞 周 期 中 ， P c N A 的表 达 仅 局 限在 细 胞
核 内 ， 其水平 在 G ．中期 时 迅 速 增 加 ， 并 在 S 期
保 持 高水 平 ， G ，／M 期 至 G 。期 时 开 始 下 降 ， 而
在 静 止 期 细 胞 中测 不 到 P C N A 表 达 ， 因 此 国 内
外 学 者将 P C N A 作 为 识 别 增 殖 细 胞 的 一 个 重 要
标 志
” J
。 P C N A 在 许 多 肿 瘤 组 织 中都 有 过 表
达 ， 并 随着 肿 瘤 恶性 度 的增 高 ， 其表达 呈 明 显
上 升趋 势 。 在 动物 实 验及 人 体实体 瘤 观 察 中发
现 P c N A 作 为 细 胞 增 殖 状 态 的标 志 与 K i 一 6 7 和
流 式 细 胞仪 有 很 好 的相 关性 ， 证 明 了P C N A 用
于 检 测 增 殖 细 胞 是 切 实 可 行 的 。 检 测 P C N A 方
法 常采用 免疫组 织 化学 法 ， 结 果 可 用 P C N A 增
殖 指 数 L I ( 即肿 瘤细胞 中P C N A 阳性 细胞 所 占
比例 ) 或相关指标评估 ， 可 反 映细胞 D N A 复制
的 活 跃 程 度
帕 。 。
。 本 实验 结 果 提 示 ， I L 一 1 8 治
疗 组 小 鼠肿 瘤组 织 P C N A 的表 达 低 于 荷 瘤 模 型
组 ， 表 明I L 一 1 8 可 以 明显 降低肿 瘤增殖 活 性 。
肿 瘤 发 生 与发 展 离不 开 新 生 血 管 的形 成 ，
新 生 血 管 为肿 瘤 细胞 增 殖 、 生 长 提 供 营养代谢
20 陈湘琦，等． 白细胞介素一18对Lewis肺癌小鼠肿瘤增殖及微血管生成的抑制作用
的同时，也促进原发肿瘤侵袭、转移。研究发
现肿瘤发生发展的每一步都与微血管的形成密
切相关，微血管的生成贯穿了肿瘤发生与发展
过程的始终，因此抑制肿瘤组织微血管的生成
可发挥良好的抗肿瘤作用 l_8 。研究证实，肿
瘤生物学行为的恶性潜能随着肿瘤MVD的增加
而明显增加。因此 ，MVD被认为是预测肿瘤
转移、复发和预后的一项重要指标，并被用于
检测肿瘤血管对抗血管生成药物敏感性的常用
指标 ö‘̈]。Cao等 ̈在动物实验中发现皮下
或肿瘤内注射IL一18治疗小鼠T241纤维肉瘤细
胞，肿瘤体积抑制平均值都大于75％；在体外
细胞培养中发现T241纤维肉瘤细胞对IL一18浓
度不敏感，相反IL一18却能有效抑制内皮细胞
增生；通过对小鼠肿瘤组织免疫组化研究进一
步证明经IL一18处理过的肿瘤表现出血管生成
低下，说明IL一18干预了肿瘤血管生成并在其
间可能起着调节开关样的作用。类似的情况在
对乳腺癌、肝癌及黑色素瘤的研究中均得到证
实 Hj。本实验结果显示，IL—l8治疗组小鼠
肿瘤组织MVD的水平低于荷瘤模型组，表明
IL一18可以显著抑制肿瘤微血管生成。
综上所述，IL一1 8可能通过控制肿瘤增殖
活性及微血管生成等途径对Lewis肺癌产生抑制
作用。相信在不久的将来，具有高效、安全等优
点的细胞因子IL一18在肿瘤的治疗中有望开辟
一 个新的局面。
[参
[1]
[2]
[3]
考 文 献]
毛友生，高燕宁，赫捷，等．肺癌分子生物学特眭与转移和
预后的关系 [J]．中华肿瘤杂志，2006，28(8)：632—634．
Seve P．Dumontet C．Chem0resistance in non-smal cel lung
cancer[J]．Curr Med Chem Anti—Cane Agents，2005，5(1)：
73—88．
Wigginton JM，Lee JK，Wiltrout TA，et a1．Synergistic
engagement of an ineffective endogenous anti tumor immune
response and induction of IFN and Fas ligand dependent
tumor eradication by combined administration of IL-1 8 and
IL一2[J]．J Immunol，2002，169(8)：4467—4474．
[4]
[5]
[6
[7
[8
[9]
[10]
[11
【12]
[13]
[14]
1waski T Yamashitan K Tsujimura T，et a1．Interleukin一18
inhibits osteolytic bone metastasis by human lung cancer cels
possibly through suppression of osteoclastie bone-resorption
in nude mice[J]．j Immunother，2002，25(Suppl 1)：52-60．
Naryzhny SN，Lee H．Characterization of proliferating cell
naclear antigen fPCNA1 isoforms in normal and cancer cells：
there is no cancer—associated form of PCNA l J]．FEBS
Let，2007，581(25)：4917—4920．
Grunnet ML，Glibert M，Hellman R，et a1．Correlation of tumor
p53 and PCNA with response and survival of glioblastoma
in patients treated with an ECOG protocol of pre-irradiation
chemotherapy [J]．Clin Neuropathol，2000，19(5)：230—
234．
Malkas LH．Herbert BS．Abdel—kziz W，et a1 A cancer-
associated PCNA expressed in breast cancer has implications
as a potential biomarker[J]．Proc Natl Aead Sci USA，
2006，lO3(51)：19472-194777．
陈公琰，洪璇．血管内皮生长因子与肺癌的关系 [J]．中
华肿瘤杂志，2005，27(8)：449—45 1．
Mulkeen AL，Silva T，Yoo PS，et a1．Shoa interfering RNA—
mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor：
Efects on cellular proliferation in colon cancer cels I J j．
Arch Surg，2006，141(4)：367—374．
Uzzan B、Nicolas P，CucheratM，et a1．Microvessel density as
a prognostic factor in women with breast cancer：A systematic
review of the literature and meta analysis l J J．Cancer Res，
2004，64 f9)：2941-2955．
Tozer GM．Measuring tumour vascular response to antivascular
and antiangiogenic drugs[J]．Br J Radiol，2003，76(Suppl
1)：23-35．
Cao R，Farnebo J，Kurimoto M，et a1．Interleukin一18 acts as an
angiogcnesis and tumor suppressor[J]．FASEB J，1999，1 3
(15)：2195—2202．
Han MY，Zheng S，Yu JM，et a1．Study on interleukin-1 8
gene transfer into human breast cancer cels to prevent
tumorigenicity [J]，J Zhejiang Univ Sci，2004，5(4)：472-
476．
Leng J，Zhang L，Yao H，et a1．Antitumor effects of
interleukin一1 8 gene-modified hepatocyte cell line on
implanted liver carcinoma[J]．Chin Med J(Eng1)，2003，
l16 f10)：1475—1479．
(收稿 日期：2008—08—06 修回日期：2008—09—22)
...
