二甲双胍对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的调控.pdf

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二甲双胍对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的调控.pdf 中国癌症杂志 2009年第19卷第1期 CHINA ONCOLOGY 2009 Vo1.19 No.1 39 二甲双胍对人肺腺癌A549~胞增殖和 凋亡的调控 [摘要 ] 背景与 目的 :二甲双胍作为一种胰岛素增敏剂被用于II型糖尿病的一线治疗。近来的临床 研究发现二甲双胍可降低糖尿病患者的肿瘤发生率,提示它可能具有抗肿瘤的作用 。本研究观察二甲双胍 对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法 :二甲双胍干预人肺腺癌A549细胞48 h 后,采用MTT法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,实时PCR法检Np53、Bc卜2~HBax mRNA 的转录情况。结果:经二甲双胍干预48 h后,人肺腺癌A549细胞的增殖受到明显抑制,且该抑制作用呈药物 浓度依赖性增加。当二甲双胍浓度为0.5、2和8 mmol/L时对细胞生长的抑制率分别为(29±5)%、(68±3)%和 (84.1±2.6)%。流式细胞术检测提示中、高浓度 (2、8 mmol/L)二甲双胍可促进A549细胞凋亡;其中,药物作 用48 h后,8 mmol/L组细胞的早期凋亡率为(2.1±0.5)%,中、晚期凋亡率为 (9±4)%,均显著高于对照组。 二甲双胍干预后细胞凋亡相关基因p53、Bc卜2{~1Bax mRNA表达均上调,且Bc卜2/Bax比值下调。 结论:二甲双 胍能显著抑制人肺腺癌A549细胞增殖,促进细胞凋亡增加;其机制可能与上调细胞凋亡相关基因p53的表达及 Bc卜2/Bax比值 下降有关 。 [关键词 ] 肺肿瘤; 癌,腺泡细胞: 二甲双胍; 增殖; 细胞凋亡; 培养的肿瘤细胞 中图分类号:R73—36 1 文献标识码:A 文章编号:1007—3639(2009)O1—0039—04 Effects of antidiabetic drug metformin on human lung adenocarcinoma cell A549 proliferation and apoptosis in vitro wU Ning,CU Hong-jun YI Hui-jun.LI Oiang (Department of Respiratory ,~edicine.Changhai Hospitai. Second Mi1itary Medical University, Shanghai 200433, China) Correspondence to:LI Oiang E-mail 1iqressh@ahoo.COIil.cn [Abstract] Background and purpose:Metformin is known to be an insulin sensitization agent and is a first line treatment for patients with type 2 diabetes.Recent clinical studies have revealed that metformin treatment has been associated with reduced cancer risk,which indicated that metformin may be a potential anti—neoplastic agent.We investigated the effects of antidiabetic dmg metformin on proliferation and apoptosis in human lung adenocarcinoma cel line A549 in vitro and explored the possible underlying mechanisms.M ethods:A549 cells were treated with O.5 mmol/L,2 mmol/L and 8 mmol/L metformin for 48 hrs.Growth inhibition rates of the cells were measured by MTT assay.Cel apoptosis were detected by flow cytometery(FCM).Expressions of three genes including p53,Bcl一2 and Bax mRNA in the cells were measured by Real—Time PCR.Results:The proliferation of A549 cels was inhibited by metformin in a dose—dependent manner.The Inhibition rates of metformin at dosage of 0.5 mmol/L,2 mmol/L and 8 mmol/L group were(29土5)%,(68士3)% and(84.1+2.6)%,respectively.Apoptosis was induced when the cels were treated with moderate to high concentrations of metformin.The percentage of cels in early and late stage of apoptosis was increased from(1.14-0-3)%and(1.78~0-22)%in controlled group to(2.1+0.5)%and(9士4)%in metformin 8 mmol/ L group,respectively.The expressions of p53,Bcl一2 and Bax mRNA were all up—regulated after metformin treatment while the Bcl一2/Bax ratio was signifcantly decreased.Conclusion.-Metformin can inhibit the proliferation of human adenocarcinoma cancer cel line A549 and induce cel apoptosis with moderate to high drug concentrations in vitro, which may partly be atributed to the up—regulation ofp53 and down—regulation ofthe Bcl-2/Bax ratio. [Key words] neoplasm; carcinoma,acinar cel;metformin;proliferation; apoptosis; cultured tumor cells 通讯作者:李强 E—mail:liqressh@yahoo com.cn 武宁,等. 二甲双胍又寸人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的调控 肺癌是严重威胁人类健康与生命的恶性肿 瘤,半个世纪以来,其发生率和死亡率在世界 各地都呈明显增高趋势。由于缺乏有效的早期 诊断手段,大部分肺癌患者在初诊时多已失去 手术时机,因此,寻求有效的非手术治疗方法 一 直是临床医师密切关注的问题。二甲双胍作 为胰岛素增敏剂,于20世纪50年代即已应用于 Ⅱ型糖尿病的治疗 ̈。近年的研究提示,降 血糖药物二甲双胍可能具有抑制肿瘤生长的作 用。本研究通过二甲双胍干预人肺腺癌细胞株 A549,观察其对细胞增殖及凋亡的影响,同时 检测了细胞凋亡相关基因Bax、Bcl一2及p53的 表达,初步探讨二甲双胍对肺癌作用的分子机 制。 1 材料和方法 1.1 材料 人肺腺癌A549细胞株购 自中国 科学院上海生命科学院细胞所。细胞培养 用胎牛血清、双抗及RPMI l640培养基购自 Hyclone公司。二甲双胍、MTT购自美国Sigma 公司。DMSO购自上海增建生物公司。Annexin V—FITC流式细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基 生物科技公司。Trizol购白美[~Invitrogen公司。 逆转录试剂盒及SYRB realtime试剂盒均购自 TaKaRa公司。PCR用引物由上海赛百胜生物公 司合成。酶联免疫检测仪为Thermo公司产品; 流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品; Real—time PCR仪为美国Applied Biosystems公司 7500型 。 1.2 细胞培养和二甲双胍干预 人肺腺癌 A549细胞常规培养于含10%胎牛血清、100 U/ ml青霉素、100 ng/ml链霉素的RPMI 1640培养 基中,培养条件为37℃,5%C0,的湿润无菌环 境。收集对数生长期的A549~m胞,按细胞量 5 X 10。FfL接种于96孔板或3 X 10 /4L接种于6;fL 板中。实验组分为对照组、二甲双胍o.5 mmol/ L组、2 mmol/L组和8 mmol/L组。细胞接种24 h 后,各组分别更换含有二甲双胍的全细胞培养 基,药物终浓度分别为0.5、2{N8 mmol/L,对 照组的培养基中加入等量的PBS。 1.3 MTT法细胞存活率测定 细胞接种于 96 孔培养板,每组设6个复孑L。二甲双胍干预 48 h后,每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液 lO l,再继续培养4 h。小心吸弃孔内培养 液,每孔加150 Ixl DMSO,避光轻微震荡5 min 使结晶充分溶解 ,酶联免疫检测仪测定吸光 度 (A)值,检测波长570 nm,以全细胞培养 液不加细胞的孑L调零。根据A值计算细胞存 活率,细胞存活率=[1一(试验:fLA 一调零孑L A ) 寸照孑 一调零:fLA )]X 100%。 1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞接种于 6;fL培养板,每组设3个复孑L。二甲双胍干预 48 h后,以不含EDTA的胰酶消化并收集各组 细胞,预冷PBS洗涤2次后,加入结合缓冲液 300 1/管,振荡重悬细胞,每管分J~,J,hn人5 l Annexin V—FITC及Propidium Iodide染料,避光 反应15 min,流式细胞仪检测细胞凋亡。 1.5 实时 PCR检测p53、Bcl一2和Bax mRNA 转录水平 药物干预细胞48 h后,Trizol法提取 各组细胞 ~,RNA,取500 ng经逆转录成cDNA 后,以cDNA产物为模板,用实时 PCR法检测 p53、Bcl一2和Bax mRNA转录,以GAPDH作为 内参照。p53引物:上游:5’.CCCTCTACAA— CATCACCACG一3’;下游:5’一TCCCTTTCAG— CAGGTCAGA一3’;产物长度为82 bp,退火温 度为60 。Bax引物:上游:5'-TGTCTGTCT— TGTCCCCTTCC.3’;下游 :5’.ACCTTGAG— CACCAGTTTGCT一3’;产物长度为301 bp,退 火温度为60℃。Bcl一2引物:上游 :5’一TC— CATGTCTTTGGACAACCA一3’;下游 :5’.CTC— CACCAGTGTTCCCATCT一3’;产物长度为203 hp,退火温度为60℃。GAPDH引物:上游 : 5’一GCACCGTCAAGGCTGAGAAC一3’;下游 : 5’一ATGGTGGTGAAGACGCCAGT一3’;产物长度 为142 bp,退火温度为56℃。实时 PCR扩增条 件为:95 30 S;95 c(=15 S,60 oC 15 S,72 45 S,共 40个循环,实验重复3次。以Rotor— Gene 6000 Series Software 1.7分析结果,目的基 因Ag}Hx,~表达量 (RQ)=2 ,以对照组 目 的基因mRNA的均数为l,计算其他各组mRNA 的相对表达量。 1.6 统计处理 实验数据用 表示 ,应用 SPSS 13.0统计软件,多组比较进行单因素方差 分析,两两比较进行LSD—t检验,尸<O.05为差 异有显著性。 2 结 果 2.1 二甲双胍对A549细胞增殖的影响 MTT “中 国 癌 症 杂 志)) 2 0 0 9 年第 1 9 卷 第 l 期 4 1 检 测 结 果 显 示 , 二 甲双 胍 干 预 4 8 h 后 , 各 组 细 胞 的生 长均 得 到 明显 抑 制 , 与对 照 组 相 比差 异 均 有 显 著性 俨 < 0 . 0 5 ) ; 且 随 着 二 甲双 胍 浓度 的 增 加 , 其对 A 5 4 9 细胞 的抑 制作用 逐 渐增 强 ( 表 1 ) 。 表 1 不 同浓 度 的 二 甲双 胍 干 预 4 8 h 后 对 A 5 4 9 细 胞 生 长 的抑制 率 1 1a b . 1 T h e g r o w t h i n h -h .t i o n r a t e s 0 f A 5 4 9 c e l l s a f t e r t r e a t m e n t b y d j r f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f m e t f o r m i n f o r 4 8 h r s 2 . 2 二 甲双 胍 对 A 5 4 9 细 胞 凋 亡 的 影 响 二 甲 双 胍 干 预 A 5 4 9 细 胞 4 8 h 后 , 收 集 细 胞 , 检 测 细 胞 凋 亡 情 况 。 结果 显 示 , 二 甲 双 胍 作 用 4 8 h 后 , 2 m m o l /L 组 和 8 m m o l /l J组 的 细 胞 早 期 及 中 晚 期 凋 亡 比 例 均 呈 增 高 趋 势 , 但 与 对 照 组 相 比 , 仅 8 m m o l /L 组 的细胞 凋 亡 率差 异 有 显 著性 (P < 0 . 0 5 ) 。 二 甲 双 胍 8 m m o l /I J组 的细 胞 凋 亡 率 与0 . 5 m m o l /L 组 相 比 差 异 也 有 显 著 性 俨 < 0 . 0 5 1 (表2 , 图 1 ) 。 表 2 二 甲双 胍 干 预 A 5 4 9 细胞 株 4 8 h 后 细 胞 凋 亡 率 T la b . 2 T h e A p o p t O t i c i n d e x O f A 5 4 9 c e l l s a f t e r t r e a t m e n t b y m p t f n r m i n f n r 4 R h r s G r O u p A p o p t o t ic i n d e x (% ,.£j b ) L a t e a lD O D t O s i C o m p a r e d w i t h c o n t r o I g r o u p ,a :JD< 0 . 0 5 ;C o m p a r e d w i t h 0 . 5 m m 0 1/L 2 r O u D :b :P < O. 0 1 . 。 1 2 r ^ 苎 1 0 ∞ U 要 8 ∞ ‘ 昌 6 2 A 星 4 时 = 2 3 0 E a r l y s t a g e L a t e s t a g e 图 1 二 甲双 胍 干 预 对A 5 4 9 细 胞 凋 亡 率 的影 响 F i g . 1 T h e i m p a c t O f m e t f o r m i n t 0 a p O p t O s i s 0 f A 5 4 9 c e l l s 2 . 3 二 甲双 胍 对 A 5 4 9 细 胞 B a x 、 B c l 一 2 及 p 5 3 m R N A 表 达 的影 响 二 甲双 胍 干 预 A 5 4 9 细胞 4 8 h 后 , 与对 照 组 相 比 , p 5 3 、 B c l 一 2 和 B a x m R N A 的转 录均 升 高 , 且 随药 物浓 度 增 高而 递 增 。 统 计学分析显 示 , 2 m m o l /I J和 8 m m o I/L 组 的p 5 3 、 B c l 一 2 和 B a x 的 基 因 转 录 水 平 均 显 著 高 于 对 照 组 ; 与对 照组 相 比 , 0 . 5 m m o l /I J组 的B a x 亦 明显 增 高 ( 尸 < 0 . 0 1 ) , 而 p 5 3 和 B c L 一 2 的表达 水 平 则差 异 无 显 著性 ( 表 3 , 图2 ) 。 表3 二 甲双 胍 对 p 5 3 、 B c l一 2 及 B a x m R N A 表 达 的影 响 T la b 3 T h e i m p a c t 0 f m e t f o r m i n t 0 e x p r e s s i o n 0 f p 5 3 , B c l - 2 a n d B a x m R N A T h e l e V e l s o f m R N A t r a n s c r i p t i o n a r e g i V e n a s R Q v a l u e s C o m p o a r e d w i t h c o n r o l g r o u p ,a :P < O. 0 5 ;b :JD< 0 . 0 1 . A M P 活 化 蛋 白激 酶 ( A M P — a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e , A M P K ) 信号 转导 通 路是 组 织 细胞 中最 重 要 的能量 代谢调 节 通 路之 一 , 对 于 维 持组 织 细胞 内A M P /A T P 的 比例 、 调 控 蛋 白与脂 肪 的合 成 与分解 , 以 及 细 胞 的应激 均 有重 要 的作用 。 近 年来 研 究 发 现 , A M P K 信 号 转 导 通 路还 参 与 了 对 肿 瘤 细 胞 增 殖 与 凋 亡 过 程 的 调 控 一 。 j 。 现 已 证 实 , 当A M P K 处 于 磷 酸 化 激 活 状 态 时 , 可 以 引起 细 胞 内p 5 3 一 p 2 1 途 径 的激 活 , 进 而 阻 滞 细 胞 周 期 进 程 ; 同时 , 活 化 的A M P K 还 可 通 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ^∞m, '【B A 星 v ∞_【0 A a _【爱 髻 响 邮 漾 影 吖 如呲 胁 嚣 挑 粼 警唧训 涮 堪 一粥 焉 吧 赃 呲 _三 喘 一 叭 之 .- Ⅲ mlu 弦 一 罴 瓣 髓 舳 眈 刚‰h 邮 一~~~ 善 溉 42 武宁,等. 二甲双胍对人肺腺癌A549~胞增殖和凋亡的调控 过抑~tJmTOR信号通路的转导而抑$~Akt通路活 性,因而对于存在Akt异常活化的肿瘤具有抑 制作用。二甲双胍是一种被临床广泛应用的安 全而有效的降糖药物。研究认为,二甲双胍在 机体内主要通过激活AMPK通路,减少肝脏糖 异生,同时增加外周组织对糖的摄取及利用, 从而降低血糖 。由此提示,二甲双胍对于 肿瘤细胞的生长可能也存在某种程度的抑制作 用。这一推论最近得到了两项大型临床研究结 果的证实 :通过对 Ⅱ型糖尿病患者的研 究发现,经二甲双胍治疗者肿瘤发病率显著下 降;伴有Ⅱ型糖尿病的肿瘤患者长期口服二甲 双胍可延长生存期,改善预后。对结直肠癌、 神经胶质瘤和生殖系统肿瘤的细胞及动物实验 研究也提示二甲双胍可以选择性地降低肿瘤的 增殖活性,促进肿瘤细胞凋亡的发生,而对正 常细胞的生长增殖则无显著影响 。本研 究结果发现,二甲双胍可以促进人类肺腺癌 A549~H]胞凋亡增加,显著抑制该细胞的生长增 殖活性;干预48 h后,二甲双胍对A549细胞生 长的最高抑制率达84%,与上述研究结果相一 致,提示二甲双胍对肺腺癌的生长增殖也有很 强的抑制作用。 Bcl一2基因家族和p53基因都是重要的细胞 凋亡相关调控因子,参与多种肿瘤的发生与进 展过程。Bcl一2和Bax同属于Bcl一2基因家族,分 别具有抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡的相反的 作用。在细胞内,二者可结合成异质二聚体而 失活,而当二者的相对表达量失衡时,则引起 细胞凋亡进程的改变。野生型p53本身是一种 经典的促凋亡基因,可以通过激活多种促凋亡 基因,包括Bax等的转录,启动凋亡程序,引 起细胞死亡。此外,p53还X~Bcl一2有特异性的 抑制作用。本研究发现,在特定浓度的二甲双 胍干预后,A549细胞内p53和Bax的mRNA转录 都明显增加;虽然当药物浓度较高时,Bcl一2 的转录水平也出现了增高,但Bcl一2/Bax的比值 下降,提示细胞凋亡增加,与流式细胞术检测 的结果相一致。这一结果提示,二甲双胍可引 起人肺腺癌A549~胞内的凋亡调控系统失衡, 从而促进细胞凋亡。 本研究结果表明,二甲双胍能促进人肺腺 癌A549细胞的凋亡,从而明显抑制该肿瘤细胞 的生长增殖;其作用机制涉及Bcl一2基因家族 及p53等多种凋亡调控基因的表达,提示二甲 双胍有可能作为一种辅助用药而应用于肺癌的 治疗。然而,目前国内外关于二甲双胍与肿瘤 生长的相关性的研究中,所使用的二甲双胍的 浓度均显著高于其作为降糖药物所需的血药浓 度 (0.465~2.5 ms/1)。尽管多项动物实验应用 高浓度二甲双胍治疗肿瘤均取得了与细胞实验 相一致的理想结果,但由于作为一种胰岛素增 敏剂,二甲双胍具有减少体内蛋白质和脂肪酸 合成、降低外周血胰岛素水平等作用,人体对 于高浓度药物是否具有良好的耐受性还需大量 的研究证实 [参 考 文 献 ] l 1 Bailex CJ,Turner RC.Metformin[J].N Engl J Med,1998, 334:574—5793. 1 2 j “J,Jiang P,Robinson M,et a1.AMPK—beta l subunit iS a p53一independent stress responsive protein that inhibits tumor cell growth upon forced expression[J j.Carcinogenesis, 2003.24:827—834. 1 3 J Hadad SM,Fleming S,Thompson AM.Targeting AMPK:A new therapeutic opporhmity in breast cancer【J] Crit Rev Oncol Hematol,2008 67f11:l一7. 4 f Hawle~SA.Gadalla AE.Olsen GS.et a1.The antidiabetie drug metformin activates the AMP—activated protein kinase cascade via an adenine nucleotide—independent mechanism l J j Diabetes,2002,5 l:2420—2425. 1 5 J Zhou G,Myers R,Li Y,et a1.Role of AMP—activated protein kinase in mechanism of metformin action l J J.J Clin Invest, 2001.108:l l67一l 174. 1 6 j Evans JM,Donnely LA,Emslie—Smith AM,et a1.Meformin and reduced risk of cancer in diabetic patients l J J.BMJ, 2005.330:1 304一l 305. 1 7 J Bowker SL,Majumdar SR,Veugelers P,et a1.Increased cancer—related mortalitv for patients with type 2 diabetes who use sulfonylureas or insulin l J j.Diabetes Care,2006,29: 254—258. 1 8 Phoenix KN,Vumbaca F,Clafey KP.Therapeutic metformin/ AMPK ac|ivation promotes the angiogenic phenotype in the ERalpha negative MDA—MB一435 breast cancer model l J J. 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