窥知- 食管癌突变型DNA聚合酶β对EC9706细胞影响的初步研究.pdf

食管癌突变型DNA聚合酶β对EC9706细胞影响的初步研究.pdf

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食管癌突变型DNA聚合酶β对EC9706细胞影响的初步研究.pdf 2 0 0 9 年第 3 6 卷第 1 期中国肿瘤临床 � 3 3 � � 基础研究 � 食管癌突变型 DNA 聚合酶岱对 E C9 7 0 6 细胞影响的初步研究：}：摘要目的：建立过量表达食管癌突变型 ( 点突变型和缺失突变型 ) D N A 聚合酶 13 (D ~ A P o l y m e r a s e B ， p o l l3 ) 的 E C 9 7 0 6 细胞系，并观察其生物学特性的变化。方法：根据 G e n B a n k D N A p o l [B 的 c D N A 序列设计引物，运用 P C R 方法，从质粒 p c D N A 3 ． 1 一 t) 0 113 中扩增出点突变和缺失突变型的 D N A p o l B 基因，作为目的片段，定向克隆至 p E G F P — N 3 真核绿色荧光蛋白表达载体，获得点突变和缺失突变型的重组真核表达载体 p E G F P — N 3 一 p o l l3 7 ，采用脂质体转染的方法，将两种突变型的 p E G F P — N 3 一 p 0 113 转染 E C 9 7 0 6 细胞系，荧光倒置显微镜观察其细胞定位，绘制生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期。结果：成功构建了点突变型和缺失突变型 p E G F P — N 3 一 p o l p 重组真核表达栽体，荧光倒置显微镜结果显示缺失突变型的 D N A p o l l3 表达以细胞胞浆为主，点突变型以细胞胞核为主，而且缺失突变型的细胞生长较对照组明显减慢 ( P < O． 0 5 ) ，点突变型与对照组相比则无明显差异 ( P > O． 0 5 ) ；缺失突变型的 D N A p ( ) l B 还可使 E C 9 7 0 6 细胞的 S 期细胞明显减少 ( P < 0 ． 0 5 ) ，而点突变型轻度减少 ( P < O． 0 5 ) 。结论：成功建立了稳定高表达人点突变型和缺失突变型 D N A t) 0 113 的 E C 9 7 0 6 细胞系，外源点突变型和缺失突变型 D N A p 0 113 在食管癌 E C 9 7 0 6 细胞表达后可以改变其生物学特性，对研究食管癌的发病机制具有重要意义、关键词 D N A 聚合酶 B 突变增强型绿色荧光蛋白生物学特性 d o i ：10 ． 3 9 6 9 ／j ． i s s n ． 10 0 0 - 8 1 7 9 ． 2 0 0 9 ． 0 1 ． 0 1 0 A P r e l i m i n a r y I n v e s t i g a t i o n o n t h e E f f e c t 0 f o V e r e x p r e s s i o n 0 f D N A P o l y m e r a s e B o n E C 9 7 0 6 E s o p h a g e a l C a n c e r C e l l L i n e Z HA O J u n 伸， L U J i n g ’ ， Y A N G H o n g y a n ’ ， H U A N G Y o u t ia n ’ ， Z HA O J im in ’ ， Z H A O M in g y a o ’ ， Z H A O G u o q ia n g ’ ， Z H A N G X i 。， D O N G Z im in g ’ C o r r e s p o n d i n g a u t h o r ：D O N G Z i m in g ． E - m a il ：d o n g z m @ z z u ． e d u ． c n ’ D e p a r t m e n t o f P a t h o p h y s j0 IO g y ， C o l le g e o f B a s ic M e d ic a l S c ie n c e s ， Z h e n g z h o u U n iv e r s it y 。 Z h e n g z h o u 4 5 0 0 5 2 ， C h i n a 。 H e j i H o s p it a l A fi l ia t e d t o C h a n g z h i M e d ic a l C o lle g e ， C h a n g z h i 0 4 6 0 1 1 ， C h in a 。 D e p a rt m e n t o f G y n e c o lo g y a n d O b s t e t r ic s ， T h e T h ir d A fi lia t e d H o s p it a l o f Z h e n g z h o u U n iv e r s it y , Z h e n g z h o u 4 5 0 0 5 2 ， C h in a G r a n t s u p p o r t ：N a t io n a l N a t u r a l S c ie n c e F o u n d a t io n o f C h in a (3 0 4 7 1 9 5 2 )， A b s t r a c t O b j e c t i v e ： T o e s t a b lis h a n E C 9 7 0 6 e s o p h a g e a l c a n c e r c e ll li n e t h a t o V e r e x D r e s s e s t h e p o i n t m u t a t io n a n d d e le t io n r e p a ir v a r ia n t s o f D N A p o ly m e r a s e p (p o l l3 ) i n e s o p h a g e a l c a n c e r a n d t o i n v e s t ig a t e t h e c h a n g e s i n t h e b io lo g ic a l c h a r a c l e r is t ic s o f t h e c e ll l in e ． M e t h o d s ： T h e p o in t m u t a t io n a n d d e le t io n r e p a ir v a r i - a n t s o f D N A p o ly m e r a s e 13 w e r e a m p lif ie d f ro m r e c o m b i n a n t e x p r e s s io n p la s m id p c D N A 3 ． 1 一 p o l 13 u s i n g P C R ． T h e p r im e r s w e r e d e s ig n e d a c c o r d in g t o t h e c D N A s e q u e n c e o f D N A p o ly m e r a s e B (G e n b a n k )． T h e p o in t m u — t a t io n a n d d e le t io n r e p a ir v a r ia n t s o f t h e D N A p o ly m e r a s e 13 g e n e w e r e c lo n e d in t o t h e p E G F P — N 3 v e c t o r ． T h e r e c o m b in a n t s w e r e t h e n t r a n s f e c t e d i n t o t h e E C 9 7 0 6 c e lI Iin e u s in g fip o f e c t a m in e ． T h e Io c a liz a t io n o f p r o t e in s e n c o d e d b y t h e 2 v a r ia n t s w a s d e t e c t e d b y i n v e rt e d fl u o r e s c e n t m ic r o s c o p y ． T h e g r o w t h c u r v e s w e r e d r a w n u s i n g r e s u lt s f ro m M T T a s s a y a n d t h e p e r c e n t a g e o f c e lls in e a c h p h a s e o f t h e c e ll c y c le w a s d e t e c t e d b y fl o w c y t o m e t ry ． R e s u l t s ： T h e s e q u e n c e s o f t h e D NA p o ly m e r a s e 13 v a r ia n t s w e r e c o r r e c t a n d t h e y w e r e s u c — c e s s f u l ly t r a n s f e c t e d in t o t h e E C 9 7 0 6 c e l l lin e ． T h e p o i n t m u t a t io n r e p a ir D NA p o ly m e r a s e 13 p r o t e in w a s m o s t - ly i n s id e t h e n u c le u s ， b u t t h e d e le t io n r e p a i r D NA p o ly m e r a s e 13 p r o t e in c o u ld b e s e e n in t h e w h o le c e ll ． T h e g r o wt h o f E C 9 7 0 6 c e l ls t r a n s f e c t e d w it h t h e d e le t io n r e p a ir v a r ia n t w a s o b v io u s ly s lo w e r t h a n t h a t o f t h e c o n ． t r o is f P < 0 ． 0 5 )． T h e n u m b e r o f c e l ls in S p h a s e w a s 3 6 ． 7 2 ％ in t h e c e lls t r a n s f e c t e d w it h p o in t m u t a t io n a n d + 本文课题受国家自然科学基金资助 ( 编号：3 9 4 7 19 5 2 ) ① 研究生，现在长治医学院附属和济医院 ② 郑州大学第三附属医院妇产科通讯作街：董子明 d o n g z m @ z z u ． e d u ． c n � 3 4 � 中国肿瘤临床 2 0 0 9 年第 3 6 卷第 1 期 d e le t io n r e p a i r D N A p o ly m e r a s e B ， a n d 2 6 ． 8 2 ％ in t h e c e lls t r a n s f e c t e d w it h t h e p o in t m u t a t io n r e p a ir D N A p o ly m e r a s e 13 a lo n e (P < O ． 0 5 )． C o n c l u s i o n ： A n E C 9 7 0 6 c e ll lin e 0 v e r e x p r e s s in g t h e p o in t m u t a t io n o r d e le t io n r e p a ir v a r ia n t s o f D N A p o ly m e r a s e B h a s b e e n s u c c e s s f u l ly e s t a b lis h e d ． T h e b io lo g ic a l c h a r a c t e r is t ic s o f t h e c e l l Iin e c h a n g e d a ft e r t r a n s f e c t io n w it h t h e D N A p o ly m e r a s e B v a r ia n t s ． T h is s t u d y w a r r a n t s f u r t h e r i n v e s t ig a ． t io n in t o t h e p a t h o g e n e s is o f e s o p h a g e a I c a n c e r ． K e y w o r d s D N A p o ly m e r a s e p ：M u t a t io n ；E n h a n c e d g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ；B io lo g ic a l c h a r a c t e r is t ic 癌基因、抑癌基因和 D N A 修复基因被称为三大肿瘤相关基因。 D N A 修复基因突变、功能以及表达水平的改变可以引起癌基因、抑癌基因突变的积累，从而导致肿瘤的发生。 p o l B 是参与 D N A 修复的主要聚合酶之一，它的改变与肿瘤发生、发展的关系尤为重要 ⋯ 。自 2 0 0 2 年本课题组利用 R T — P C R 、 S S C P 和序列分析研究发现了人食管癌中存在着 p o l B 的突变 b 。，其中以 6 4 2 n t G — T 、 6 4 8 n t G — C 、 6 6 5 n t T — C 三个点突变 (p o i n t m u t a t i o n ， p in t ) 和 1 7 7 — 2 3 4 n t ， 5 8 b p 缺失突变 ( d e l e t i o n m u t a t i o n ， d m t ) 为食管癌中的热点突变形式。本科室已运用分子生物学技术将突变型的 p o l B 构建成载体，为进一步研究其细胞定位和对细胞的生物学特性的影响，我们将 p o l B 与绿色荧光蛋白基因融合，构建真核表达载体，并研究其细胞定位和对食管癌 E C 9 7 0 6 细胞的影响。 1 材料与方法 1 ． 1 材料重组绿色荧光蛋白表达载体 p E G F P — N 3 为中国人民解放军总医院母义明博士惠赠，食管癌点突变型和缺失突变型重组真核表达载体 p c D N A 3 ． I — p o l 8 为我室构建， p G E M — T E a s y 载体试剂盒， H i n d m 和 B a m H I 内切酶， T 4 连接酶， T a q 聚合酶购于 P r o m e g a 公司，小提质粒和凝胶回收试剂盒购于 Qi a g e n 公司，食管癌细胞系 E C 9 7 0 6 由中国科学院肿瘤研究所惠赠，脂质体 L i p o f e e t a m i n e 、 ( 弭 1 8 购于 G I B C O 公司。 M T T 购于 S I G M A 公司，细胞周期试剂盒购于 B D 公司。 1 ． 2 方法 I ． 2 ． 1 引物设计根据 G e n B a n k M l 3 14 0 提供的 p o l 6 的 c D N A 序列和所选用的质粒 p E G F P — N 3 设计一对带有 H i n d $ 和 B a m H I 酶切位点的p o l B 全基因引物 P 1 ， P 2 。一对用于鉴定重组点突变 p E G F P — N 3 一 p o l B 质粒的通用鉴定引物 P 3 ， P 4 。在 p o l B 序列 A T G 上游加有一段 K o z a k 序列。 B — a c t i n 引物 P 5 ， P 6 ，引物由上海生工生物工程公司合成。 P 1 ：5 ’ ～ G c A A G c r丌 c c C A c c A T G A G C A A A C G G A A G G C G C A G G 一 3 ’ ：P 2 ： 5 ' - C T G G A T C CT T C G C T C C G G T C C T Y G G G T FC 一 3 ’ ；P 3 ：5 ' - G C A A A T G G G C G G T A G G C G T G - 3 ’ ；174 ：5 ' - A C C C C G G T G A A C A G CT C CT C - 3 。；P 5 ：5 ’ 一 A T C A T G AA G T G T G A C GT G G A C - 3 ’ ； P 6 ：5 ’ 一 A A C C G A C T G CT G T C A C CT T C A - 3 ’ 。 1 ． 2 ． 2 突变型 p a l B 的 P C R 扩增在过夜培养的 L B 固体培养基上取含两种突变型 p c D N A 3 ． 1 一 p a l B 的菌苔少许进行 P C R 扩增。 1 ． 2 ． 3 突变型 p o l B 的 T — A 克隆按凝胶回收试剂盒说明书回收纯化 P C R 产物，琼脂糖凝胶电泳鉴定。进行 T - A 克隆用氯化钙法制备感受态，连接产物转化大肠杆菌 E ． e o l i J M l 0 9 ，涂抹至预先含有 I P T G ／X — g a l／氨苄青霉素的平板上，进行蓝白筛选，阳性菌落进行 T 7 ， S P 6 通用引物 P C R 扩增鉴定，并／J顺粒用 H i n d lll 和 B a m H I 酶切鉴定，得到重组质粒 p G E M — T — p o l B 。 1 ．2 _4 突变型 p o l 13 真核绿色荧光表达载体的构建 ¨ ’ 制备 p E G F P — N 3 双粘质粒和测定浓度 ⋯ ’ 。同时用 H i n d m 和 B a m H I 双酶切重组质粒 p G E M — T — p o l B ， Qi a g e n g e l e x t r a c t k i t 回收酶切片段，胶回收产物和双粘质粒 16 ℃ 连接过夜，转化 D H 5 OL 大肠杆菌于卡那霉素阳性的 L B 平板上，初筛阳性克隆。用通用引物 P 3 ， P 4 进行 P C R 扩增筛选，阳性克隆分别再用通用引物 P 3 ， P 4 和 P 1 ， P 2 二次 P C R 扩增鉴定，再用提质粒 H i n d m 和 B a m H I 双酶切鉴定。经上述方法鉴定后的重组质粒送 D N A 序列分析。 1 ． 2 ． 5 细胞培养和基因转染 E C9 7 0 6 细胞常规培养，按 4 × 10 4 ／孑L细胞数接种于 2 4 孑L板，进行脂质体转染阻 ’ 。用点突变型 p E G F P — N 3 一 p o l t3 、缺失突变型 p E G F P — N 3 一 p o l 13 和 p E G F P — N 3 转染 E C 9 7 0 6 细胞，获得点突变型 E C 9 7 0 6 一 p m t p o l p 、 E C 9 7 0 6 一 d m t p o l p 和 E C 9 7 0 6 一 n e o 。细胞。 1 ． 2 ． 6 形态学观察荧光倒置显微镜动态观察转染两种突变型 p E G F P — N 3 一 p o l B 重组质粒和转染 p E G F P — N 3 的 E C 9 7 0 6 细胞。 1 ． 2 ． 7 R 卜 P C R 检测 D N A p o l B m R N A 的表达按 T r i z o l 说明书抽提细胞总 R N A ，逆转录后 P C R 扩增。扩增产物 1 ． 5 ％琼脂糖凝胶电泳。 S Y N 2 G E N E 凝胶分析系统软件分析电泳结果，用 p o l p 与 p — a c t i n 积分吸光度值的比值表示 D N A p o l 8 基因的相对表达水平。 1 ． 2 ． 8 细胞增殖特性分析分别接种 E C 9 7 0 6 、 E C 9 7 0 6 一 p m t p o l B 、 E C 9 7 0 6 一 dm t p o l p 和 E C 9 7 0 6 一 n e o ‘ 细胞于 9 6 ：f L板， 2 X 10 3 ／孑L ，每种设 5 个复孔，无细胞组为 c o n t r o l ，每天取 1 块板，采用 M T T 法在 4 9 2 n m 检测 O D 值，绘制生长曲线。 2 0 0 9 年第 3 6 卷第 1 期食管癌突变型 D N A 聚合酶 13 5@ E C 9 7 0 6 细胞影响的初步研究 � 3 5 � 1 ． 2 ． 9 突变型 p o l B 蛋白对细胞周期的影响取对数生长期的 E C 9 7 0 6 、 E C 9 7 0 6 一 p m t p o l 13 、 E C 9 7 0 6 一 d m t — p o I 13 和 E C 9 7 0 6 - F i e 0 ‘ 细胞，用流式细胞仪对 D N A 进行定量分析。资料用 M a d fi t L T f o r M a c 3 ． 0 软件分析处理。 1 ． 2 ． 1 0 S P F 值和 D I 值的测定运用下列公式计算：S P F 值 = S ／( G d G ；+ s + G1／M ) × 1 0 0 ％， D I 值 = ( 样品细胞的 G d G 。峰均道数 )／( 正常细胞的 G 0 ／G 。峰均道数 ) × 1 0 0 ％。 1 3 统计学方法本实验统计方法均采用 S P S S l 0 ． 0 统计软件。生长曲线数据、 F C M 参数运用多因素方差分析，率的比较采用 x 。检验。以 a = 0 ． 0 5 为水准。 2 结果 2 ． 1 目的基因 P C R 扩增用 P 1 ， P 2 扩增点突变型 p c D N A 3 ． 1 一 p o l p 产生的目的条带在 1 0 2 9 b p 附近，而缺失突变型在 9 6 9 b p 附近 ( 图 1 ) 。 M ：M a r k e r ；1 ：p m t D N A p o l 13 ；2 ：d m t D N A p o l 13 图 1 突变型 D N A p o l 8 基因片段扩增图谱 F i g u r e 1 A m p l if i c a t i o n o f D N A p o l 13 g e n e b y P C R 2 ． 2 重组表达载体的鉴定 2 ． 2 ． 1 P C R 快速扩增筛选鉴定结果 P C R 扩增后显示点突变型和缺失突变型 p o l 13 特异性条带，点突变型位于 1 0 2 9 b p 附近，缺失型位于 9 6 9 b p 附近，未插入的条带位于 2 1 0 b p 附近。 2 ． 2 ． 2 双引物 P C R 扩增鉴定和双酶切鉴定筛选后的阳性重组子用 P 1 ， P 2 和 P 3 ， P 4 双引物二次鉴定，可见：P 1 ， P 2 扩出的条带较 P 3 ， P 4 扩出的分子量略小。再小提质粒， H i n d m 和 B a m H I 双酶切鉴定，结果可见点突变型： 1 0 1 7 b p ， 4 7 0 0 b p 附近两条带，缺失型 9 7 9 b p ， 4 7 0 0 b p 附近两条带 ( 图 2 ) 。 2 -3 重组质粒的序列分析 L B 液体培养基过夜培养重组的两种突变型质粒，取 1 ． 5 ¨ l 测序，结果点突变型 1 0 2 9 b p ，缺失突变型 9 6 9 b p 序列读码框序列正确。 2 ． 4 荧光显微镜观察 p E G F P — N 3 一 p o l B 编码的蛋白质在细胞内的分布在荧光显微镜下观察 E C 9 7 0 6 、 E C 9 7 0 6 一 p m t p o l p 、 E C 9 7 0 6 一 d m t p o l 13 和 E C 9 7 0 6 一 l l e o ’ 细胞发现，除 E C 9 7 0 6 细胞，其它转染细胞均可在 4 8 8 n m 波长下发出绿色荧光，说明转染成功。不同的是， E C 9 7 0 6 一 d m t p o l 13 和 E C 9 7 0 6 一 n e o ‘ 细胞激发出的绿色荧光在细胞核与胞浆中无明显差别，整个细胞呈均匀绿色 ( 见图 3 A ， C ) ，而 E C 9 7 0 6 一 p m t p o l 13 细胞虽然整个细胞都可见绿色荧光，但胞核内的荧光强度明显强于胞质 ( 网 3 B ，箭头所指为胞核 ) 。 2 0 0 0 h n 一 1 0 0 0 h l l — M ：M a r k e r ( 2 0 0 0 L ) ；l ， 2 ， 4 ：p E G F P — N 3 ， p m t p E G F P — N 3 一 p o l l3 和 d m t p E G F P — N 3 一 p o l B 质粒用 H i n d 111 单酶切； 3 ， 5 ： p in t — p E G F P — N 3 一 p o l 13 的 d m t p E G F P — N 3 一 p o l 13 用 B a m H I 和 H i n d m 双酶切；6 ， 8 ：p m I p E G F P — N 3 - p o l p 和 d m t p E G F P — N 3 一 p o l 13 用 P 3 ， P 4 弓I物扩增；7 ， 9 ：p m ! p E G F P — N 3 一 p o l 13 和 d m t p E G F P — N 3 - p o l 13 用 P l ， P 2 弓『物丰J 。增罔 2 重组突变型表达载体 p E G F P — N 3 一 p o l 13 酶切图谱和 P C R 扩增鉴定图谱 F i ~ i ' e 2 E n z y m a t i c m a p a n d P C R a m p l i fi c a t i o n o f r e c o b i n a n t p E G F P — — N 3 — — p o l 13 2 ． 5 R T — P C R 检测 p o l B m R N A 的表达用引物 P 1 ， P 2 扩增， B — a c t i n 为内参 (4 6 0 b p ) ， R T — P C R 结果示未转染的 E C 9 7 0 6 细胞、 E C 9 7 0 6 一 n e o ‘ 细胞和 E C 9 7 0 6 一 p m t p o l B 均扩增出的条带在 1 0 2 9 b p 处， E C 9 7 0 6 一 p m t p o l B 的条带强于 E C 9 7 0 6 一 n e o ‘ ， E C 9 7 0 6 一 d m t p o l B 细胞的条带在 1 0 0 0 b p 处，条带较粗，强于 E C 9 7 0 6 一 n e o ’ ，为细胞本身的和外源的缺失型的 p o l B 条带。、 2 ． 6 p E G F P — N 3 一 p o l B 转染细胞增殖速度变化与未转染的 E C 9 7 0 6 细胞相比， E C 9 7 0 6 一 n e o ‘ 细胞的生长速度变化不大 ( P > O ． 0 5 ) ，从第 4 天开始， E C 9 7 0 6 一 p m t p o l B 细胞的生长速度较快 ( P < O． 0 5 ) ，到第 6 天则与 E C 9 7 0 6 无明显差异 ( ／ 3 > 0 ． 0 5 ) ，而从第 4 天开始， E C 9 7 0 6 一 d m t p o l 13 细胞的生长速度较慢 ( P < 0 ． 0 5 ) ，到第 6 天减慢更明显，与 E C 9 7 0 6 相比有明显差异 ( P < 0 ． 0 5 ) ，见图 4 。 2 ． 7 p E G F P — N 3 一 p o l 13 转染细胞的细胞周期未转染的 E C 9 7 0 6 细胞 s 期细胞比例为 4 4 ． 8 4 ％、 E C 9 7 0 6 一 n e 0 ’ 细胞 s 期细胞比例为 4 1 ． 3 7 ％，而 E C 9 7 0 6 一 p m t p o l 13 细胞的 S 期细胞为 3 6 ． 7 2 ％， E C 9 7 0 6 一 d m t p o l B 细胞的 S 期细胞为 2 6 ． 8 2 ％，可见突 � 3 6 � 中国肿瘤临床变型 D N A p o l B 转染的 E C 9 7 0 6 细胞 s 期细胞减少，以 E C 9 7 0 6 一 d m t p o l B 细胞明显 ( P < 0 ． 0 5 ) ，见图 5 。 2 ． 8 转染细胞各组间 D I 值和 S P F 值的变化比较各组的 D I 值和 S P F 值，发现各组的 D I 值无明显差异 (_P> 0 ． 0 5 ) ，均为近二倍体细胞；E C 9 7 0 6 一 p m t — p o l B 细胞的 S P F 值较低于 E C 9 7 0 6 和 E C 9 7 0 6 一 n e o 。 ( P < 0 ． 0 5 ) ；而 E C 9 7 0 6 一 d m t p o l B 细胞的 S P F 值比 E C 9 7 0 6 和 E C 9 7 0 6 一 n e o 。的明显降低(P < 0 ． 0 5 ) ，见表 1 。 A ：E C 9 7 0 6 一 n e o ’ ；B ：E C 9 7 0 6 一 p m t p o l p ；C ：E C 9 7 0 6 - d m t p o l B 图 3 D N A p o l B 蛋白在 E C 9 7 0 6 细胞中的分布 ( 箭头所指为胞核 ) F i g u r e 3 D i s t r i b u t i o n o f D N A p o l p p r o t e i n i n E C 9 7 0 6 c e l l s × 4 0 0 ' ~ e o n t l " 0 1 — ● 一 E C 9 7 0 6 E C 9 7 (址 n e Ⅳ E C 9 7 0 6 一 p m t p o l B — * 一 E c 9 7 0 “ d m ‘p o l B 时间 ( 天 ) 图 4 E C 9 7 0 6 各转染组和对照组的生长曲线 F i gu r e 4 G r o w t h c u r v e s o f a l l t h e g r o u p s ┏━ ┳━┓ ┃ 日黼。。 ┃ 圈罄随 ┗┻┛ A ：E C 9 7 0 6 ；B ：E C 9 7 0 6 一 u e o ’ ；C ：E C 9 7 0 6 一 p m t p o l B D ：E C 9 7 0 6 一 d m t p o l B 图 5 E C 9 7 0 6 转染各组和对照组细胞周期 F i g u r e 5 C e l l c y c l e d i s t r i b u t i o n o f e a c h g r o u p 表 1 不同转染细胞各组间 F CM参数比较；±s T a b l e 1 C o m p a r i s o n o f F C M p a r a m e t e r s a m o n g d i f f e r e n t g r o u p s 骖cM参甄i i 麓HⅣ瞒，：；E鳓枷eor E c 9 7 06_pmt ■Ec 9 7 0 6一 d ml 3 讨论 D N A p o l B 是真核细胞中最小的一种 D N A 聚合酶，其生物学功能主要表现在 D N A 修复 ( 参与碱基切割修复和错配修复 ) 和跨损伤 D N A 合成。文献报道，在胃癌细胞系和胃癌组织 b ’ 、宫颈癌 m 、前列腺肿瘤细胞系 ”’ 发现了 p o l B 基因热点突变形式。本课题组的前期研究发现旧’ ，食管癌组织细胞中的 p o l B 表达上调， p o l B 基因 1 7 7 — 2 3 4 区段 5 8 b p 的大片段缺失和 p o l B 基因的 6 4 2 ～ 6 7 0 区段集中的 3 个点突变，可能是食管癌中 p o l p 的热点区域。为了使 p o l p 的表达更有利于观测，我们将两种突变型的 p o l B 与 E G F P 融合，构建了融合基因的真核表达载体，通过脂质体转染的方法将其转染到食管癌 E C 9 7 0 6 细胞中，观察其生物学特性变化 ⋯ 。 E G F P 本身不是核蛋白，它的浓聚不可能由其本身引起，只能是由与之融合的目的蛋白( p o l B 是核蛋白)所引起。绿色荧光和 R T — P C R 结果均证实外源基因存在。点突变的 p o l B 在转染后仍然能表达在细胞核中，说明核定位序列 (N L S — N u c l e a r L o — c a l i z a t i o n S e q u e n c e ) 未受到影响。而缺失突变型的 p o l B 却由于缺失了 5 8 b p ，导致其中基因序列 4 6 2 位 G — T 导致 1 17 位出现终止码，使 p o l B 翻译到 1 1 7 位氨基酸终止，这种截短的蛋白表达异常，影响了蛋白质向核内运输过程中一些蛋白的表达，未能在细 2 ()0 9 年第 3 6 卷第 1 期食管癌突变型 D N A 聚合酶 B 对 E C 9 7 0 6 细胞影响的初步研究 � 3 7 � 胞核中表达。从转染组和对照组的生长曲线和细胞周期发现， E C 9 7 0 6 一 d m t p o l B 细胞的生长速度从第 4 天起就开始减慢， E C 9 7 0 6 一 d m t p o l B 细胞的细胞周期 S 期细胞比例明显减小。按理论分析，转染突变型的 p o l B 的细胞应该增殖速度增快，进入 s 期的细胞增多，与我们的实验结果不一致，这可能由于过表达的突变型的 p o l B 影响了调控 E C 9 7 0 6 细胞进入 s 期的蛋白的表达。 M a t s u d a 等阳’ 和 B e r g o g l i o 等 ”刮研究发现在 B E R 中 p o l p 突变体可代替野生型 p o l p ，单核苷酸的缺口合成表现出更低的保真度。癌症细胞中易错的 p o l B 过表达能干扰功能高特异性 D N A 聚合酶在无误 D N A 活动中的作用。这一体外复制资料对为何聚合酶的过表达能干扰哺乳动物细胞的遗传不稳定性提供了一个可能的解释 ⋯ 。。这些研究为 p o l B 的上调与肿瘤发生、发展的关系以及肿瘤分子机制的探索提供了一定的参考依据。本研究为 p o l B 基因突变及功能异常在肿瘤发生、发展中奠定了基础，对进一步阐明肿瘤的分子发病机制，对肿瘤的基因治疗有重要意义。但过表达的缺失突变型的 p o l B 是否在体内会影响肿瘤的生长增殖，这也是本课题组进一步的研究内容。参考文献 1 鹿伟，傅剑云． D N A 合酶B与肿瘤关系的研究进展口] ．现代预防医学，2 0 0 6 ，3 3 (1 2 )：2 3 4 4 - 2 3 4 6 2 Z h a o G Q W a n g T ， Z h a o Q e t a1 ． M u t a t i o n o f D N A p o l y m e r a s e b e t a i n e s o p h a g e a l c a r c in o m a o f d i f f e r e n t r e g i o n s []] ． W o r l d J G a s - t r o e n t e r o l ， 2 0 0 5 ， 1 1 (3 0 J ：4 6 1 8 - 4 6 2 2 ． 3 赵军，黄幼田，路静，等．食管癌点突变型 D N A 聚合酶 B与绿色荧光蛋白重组表达载体的构建Ⅱ]．山东医药，2 0 0 5 ，4 5 (7 )：1 3 — 1 5 ． 4 赵军，路静，宋谦，等． D N A 聚合酶 8过表达对食管癌 E C 9 7 0 6 细胞系的影响Ⅱ]．世界华人消化杂志，2 0 0 5 ，1 3 (1 2 )：1 3 7 7 — 1 3 8 1 ． 5 T a n X H ， Z h a o M ， P a n K F ， e t a 1． F r e q u e n t m u t a ti o n r e l a t e d w i th o v e r e x p r e s s i o n o f D N A p o l y m e r a s e b e t a i n p r im a r y t u m o r s an d p r e c a n c e r o u s l e s i o n s o f h u m an s t o m a c h ~ ． C an c e r L e t t ， 2 0 0 5 ， 2 2 0 (1 ) ：1 0 1 - 1 1 4 ． 6 韩丽萍，董子明，乔玉环，等．宫颈癌组织中 D N A 聚合酶 B基因突变检测 Ⅱ】．郑州大学学报 (医学版)，2 0 0 4 ，3 9 (6 )：9 9 5 — 9 9 7 ． 7 W a n g L ， B h a t t a c h a r y y a N ， C h e l s e a D M ， e t a 1． A n o v e l n u c l e a r p r o t e i n ． M G C 5 3 0 6 in t e r a c t s w i 山 D N A p o l y m e r a s e b e t a an d h a s a p o t e n t i al r o l e in c e l l u l ar p h e n o t y p e ~]． C an c e r R e s ， 2 0 0 4 ， 6 4 (2 1 ) ：7 6 7 3 - 7 6 7 7 ． 8 赵国强，郑乃刚，赵勤，等．人食管癌组织中 D N A 聚合酶 8基因突变特点分析 Ⅱ]．郑州大学学报 (医学版)，2 0 0 3 ，3 8 (4 )：4 9 8 - 5 0 1 ． 9 M a t s u d a T ， V an d e B e r g BJ ， B e b e n e k K ， e t a 1． T h e b a s e s u b s t i tu - ti o n fi d e l i t y o f D N A p o l y m e r a s e b e t a - d e p e n d e n t s in g l e n u — c l e o t i d e b a s e e x c i s i o n r e p a i r 0] ． J B i o l C h e m ， 2 0 0 3 ， 2 7 8 (2 8 )： 2 5 9 4 7 - 2 5 9 5 1 ． 1 0 B e r g o 班0 V ， P ill a i r e 明， L a c r o i x - T r i k i M ， e t a 1． D e r e g u l a t e d D N A p o l y m e r a s e b e t a i n d u c e s c h r o m o s o m e in s t a b i l i t y an d tu - m o r i g e n e s i s [J] ． C an c e r R e s ， 2 0 0 2 ， 6 2 (1 2 )：3 5 1 1 - 3 5 1 4 ． 1 1 S e r v an t L ， B i e th A ， H a y a k a w a H ， e t a 1． I n v o l v e m e n t o f D N A p o l y m e r a s e b e t a in D N A r e p l i c a ti o n an d m u t a g e n i c c o n s e q u e n c e s Ⅱ] ． J M o l B i o l ， 2 0 0 2 ， 3 1 5 (5 )：1 0 3 9 - 1 0 4 7 ． (2 ()(】8 一 0 5 — 1 2 收稿 ) (2 0 0 8 — 0 8 一 1 2 修回 ) ( 董恒磊校对 ) 书讯由方志沂教授主编，中国抗癌协会乳腺癌专业委员会组织全国著名乳腺癌防治专家参加编撰的国家 “ 十一五 ” 重点图书，中国肿瘤医师临床实践指南丛书之一《乳腺癌》已于 2 0 0 7 年 7 月由北京大学医学出版社出版。该书兼顾乳腺癌领域最新研究成果的介绍和临床规范化实用技术的阐述，主要内容涉及预防、流行病学、临床检诊等基本知识，同时避免类似书籍中基础内容过多的重复，对乳腺癌诊断、治疗中的新技术、新成果，结合国内外的经验，尤其对较成熟或较有发展前景的研究均有重点介绍。内容详实，图文并茂，即兼顾前沿且重点突出此为本书的特点，可作为乳腺肿瘤专业医师、普外工作者及其相关基础研究人员的一本有价值的参考书籍和教材。每册定价 5 9 元，全国新华书店均有售。 ...

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