E2F-1过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因表达的影响.pdf
E2F-1过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因表达的影响.pdf
!癌症" !"#$%&% ’()*$+, (- .+$/%*# 0112# 03$45%&556785531
!基础研究!
59 广西医科大学第一附属医院
胃肠腺体外科"
广西 南宁 :;<<05
09 广西医科大学第一附属医院
麻醉科"
广西 南宁 :;<<05
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通讯作者!肖 强
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C%,9# 3794;2664773<7
D+E# 3796649:;:3;0:
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基 金 项 目! 国 家 自 然 科 学 基 金 项
目$K(9 ;137106;%
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收稿日期!0112O1PO5;
修回日期!0112O17O00
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"摘 要# 背 景 与 目 的!F0NO5$F0N ?*+$&/*#=?#($ -+/?(* 5%基 因 是 细 胞 周 期 的 重 要
转录因子&也参与了细胞凋亡的过程&但机制尚不明确’ 本研究通过观察 F0NO5 过
表达对胃癌细胞 QR.O31; 凋亡的影响及对下游基 因 的 调 控& 初 步 探 讨 其 参 与 凋
亡的分子机理’ 方法!用流式细胞仪检测稳定转染 F0DO5 的胃癌 QR.O31; L F0DO5
细胞$实验组%(转染空载体的 QR.O31; L FS$阴性对照组%及未转染的 QR.O31; 细
胞的凋亡情况’ 再 分 别 抽 取 QR.O31; L F0DO5 和 QR.O31; 细 胞 的 总 TKU&采 用 逆
转录的方法& 制成 /VKU&并以两种荧光 .J: 和 .J; 标记 后作为探针$荧光交换芯
片%&与含有 05 :00 条人类基 因 表 达 谱 芯 片 进 行 杂 交’ 采 用 W)EM/+$ 5<X L U 双 通
道激光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号&应用 W)EM/+$;9< 图像分析软件对芯片图
像进行处理和分析与 凋亡相关的基因的表达&再 用 TCOY.T 针 对 性 的 对 筛 选 得 到
的基因进行验证’ 结果!QR.O3<; L F0DO5 组细胞 的 凋 亡 率 明 显 高 于 QR.O3<; L FS
组和 QR.O3<; 组&; 组凋亡率分别为$39P<Z1925%[( $P9:;Z<974%[( $P926Z<9P6%[)
基 因 芯 片 扫 描 筛 选 出 与 凋 亡 相 关 的 差 异 表 达 基 因 4: 条& 其 中 上 调 基 因 P条&下
调 基 因 44 条)TCOY.T 验 证 多 条 相 关 基 因 其 上( 下 调 趋 势 同 基 因 芯 片 结 果 一 致’
结 论!F0NO4 基因过表达促进了胃癌 QR.O3<; 细 胞的凋亡& 其影响机制可能与这
4:条差异表达基因有关系’
关键词!胃肿瘤) F0NO4) 基因表达谱芯片) 差异表达基因) 凋亡
中图分类号!T6;:90 文献标识码!U
文章编号!4<<<8P76B$0<<2%44844678<:
<=>?@ 过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因
表达的影响
严林海 4" 李 雷 4" 谢玉波 0" 肖 强 4" 王长青 4
<AA1’$# +A <=>?@ +31%1BC%1##2+- +- &C+C$+#2# +A *&#$%2’ ’&-’1% ’177# &-.
1BC%1##2+-# +A &C+C$+#2#?%17&$1. *1-1#
R*’/[&* \&’&. R1* R*&. \7/], ^*1&" _*&’; ^*&,. &’8 ?6&’;/_*’; ‘&’;.
!!"#
C M Y K
肿瘤细胞的凋亡是一个多因素!多步骤!序贯
的复杂过程"涉及多种基因及产物相互作用和多种
信号通路相互调节 #!$"目前普遍认为诱导肿瘤细胞
凋亡是成功治疗肿瘤的基础和关键% "#$%& 基因是
细胞周期的重要转录因子"在细胞凋亡的过程中扮
演重要的角色"有关 "#$%& 基因在凋亡中的作用已
有一些报道##"’$"但机制尚不十分明确% 本研究通过
流式细胞仪检测稳定过表达 "#$%&"及观察其对胃
癌细胞凋亡的影响"并利用基因表达谱芯片技术高
通量的特点筛选过表达 "#$%& 胃癌细胞 ()*%+,’
与凋亡相关的差异性表达基因"初步探讨 "#$%& 过
表达对胃癌细胞凋亡影响的可能的分子机制%
! 材料与方法
!"! 材料
人胃癌 ()*%+,’ 细胞株购自中国科学院上海
生 物 细 胞 研 究 所 " 稳 定 过 表 达 "#$%& 的 细 胞 株
&()*%+,’ - ".$%&’ 和 转 染 空 质 粒 的 细 胞 株&()*%
+,’ - "/’由本室保存% 流式细胞仪 "01*2 34%(*4
购 自 美 国 56789:; *<=>?6@ 公 司 "A@BC<> 为 美 国
1;DB?@<E6; 公司产品"基因表达谱芯片采用博奥生物
公 司 提 供 的 ## 8 人 类 基 因 组 寡 核 苷 酸 芯 片 "
4=F27:; !,G - H 双 通 道 激 光 扫 描 仪 购 自 *:IB?:>5B<
公 司 "4BI<J67?:9B;6 .,,, 脂 质 体 转 染 盒&1;DB?@<E6;
生 产 ’" 逆 转 录 相 关 试 剂 为 (51 $6@96;?:K 生 产 "
LMH *>6:;%=I GB? &(M’纯化试剂盒为 *:IB?:>5B< 生
产 ""3%!"# 为 A:G:L: 公 司 生 产 "!,, NI OMH
(:@86@ 为东盛生物科技公司生产%
!"# 方法
&P.P! 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期
细胞"弃去培养液"胰酶适度消化细胞"用培养液吹
打"! ,,, @ - 9B;" 离心 Q 9B; 去上清% 用 052 洗涤
细胞"调整待测细胞的密度为 QR&,QS&R&,T - 94"取
& 94 细胞"& ,,, @ - 9B;"UV离心 &, 9B;"弃上清%
加入 & 94 冷的 052" 轻轻振荡使细胞悬浮"& ,,,
@ - 9B;"UV离 心 &, 9B;" 弃 上 清 " 将 细 胞 重 悬 于
&,, !4 NB;WB;E N=JJ6@" 加入 H;;6FB; " 轻轻混匀"
避光反应 UV ’, 9B;" 加入 01 反应 &, 9B;% 加入
U,, !4 的 NB;WB;E N=JJ6@ 在 & X 内上机检测% 流式
细胞仪分析&流式细胞仪激发光波长用 U++ ;9"用
波长为 Q&Q ;9 的通带滤器检测 $1A* 荧光"另一波
长大于 QT, ;9 的滤器检测 01’%
&P.P. 基因芯片技术进行基因表达差异性分析及
荧光交换实验 A@BC<> 一步法分别提取两组细胞的
总 LMH" 采用 M=7>6<2IB;LMH!7>6:;%=I 试剂盒进
行总 LMH 纯化"然后用分光光度计定量"甲醛变性
胶 电 泳 对 总 LMH 的 质 量 进 行 质 检 ( 以 AY Z>BE<
&WA’I@B96@ 为引物" 用 7OMH 2[;?X6KBK GB? 合成双
链 7OMH% 用 AY ";C[96 (BF 将双链 7OMH 进行体
外转录合成 7LMH"用 *N727@BI? #逆转录酶" 随机
引 物 进 行 反 转 录 " 再 纯 化 % 再 以 随 机 引 物 进 行
7OMH 的 G>6;<\ 酶标记"在第一张芯片上"对照样
品标记红色的 *[Q 荧光素" 处理样品标记绿色的
*[’ 荧光素(而在第二张芯 片 上"对 照 样 品 标 记 绿
色的 *[’ 荧光素"处理样品标记红色的荧光素% 处
理之后的 7OMH 探针和寡核苷酸 芯 片 在 杂 交 液 中
U.V杂 交 过 夜 " 然 后 洗 脱 ! 甩 干 % 最 后 芯 片 用
4=F27:; &,G - H 双通道激光扫描仪进行扫描%
&P.P’ 芯 片 图 像 的 采 集 与 数 据 分 析 采 用
4=F27:; ’P, 图 像 分 析 软 件 &*:IB?:>5B< 公 司 ’对 芯
片图像进行分析% 先把图像信号转化为数字信号"
根 据 *[Q 和 *[’ 总 体 信 号 的 E><N:> 96:; 对 各 芯
片 进 行 片 间 线 性 校 正 ( 然 后 对 芯 片 上 的 数 据 用
4<\6KK 方 法 进 行 归 一 化( 最 后 以 差 异 为 .P, 倍 为
标准"即 *[Q - *[’ 比 值&L:?B<’].P, 或^,PQ 作 为 阳
性结果"来确定差异表达基因%
&P#PU 基 因 芯 片 质 量 控 制 _6F!外 标 !内 标 等 阳
性对照信号正常"阴性对照检测为阴性(片内看家
基因重复性好"L:?B< 值 */ 不超过 ,P’( 无影响数
据的污染"漏点率不超过 ’‘"检测率正常%
&P.PQ LA%0*L 对 基 因 芯 片 的 验 证 LMH 提 取 严
格按照试剂盒的要求完成" 所得 LMH 纯度符合要
求" 引物的设计与合成" 根据 )6;5:;8 上的人类
)H0O_ 基 因 的 9LMH 序 列 资 料 &)6;5:;8 序 号)
M(a,,.,UT’" 使用引物设计软件 0@69B6@ QP, 设计
&)H0O_%b" )H0O_%4’引 物 "扩 增 )H0O_ 目 的
片段"引物由上海生工生物工程有限公司合成"逆
转录和 0*L 反应 严 格 按 照 试 剂 盒 操 作 说 明 进 行%
LA%0*L 程序)cQV Q 9B; 酶激活( 扩增反应)cQV
UQ K 变性(Q,ST,V ’, K 退火&温度视引物情况来确
定’(Y.V &QS’, K 延伸&时间视产物长度来确定’(
Y.V &, 9B;(共进行 ’, 个循环"反应结束后"由电
脑自动分析计算出定量结果"LA%0*L 扩增目的片
段检测及数据处理)取 &S’ !4 产物进行 &PQd琼脂
糖凝胶电泳"摸索条带亮度至最适% 利用凝胶成像
系统半定量灰度比值"检测各目的基因的表达量%
!"$ 统计学处理
应用 2022&’P, 统计软件进行分析% 计量资料
严林海!等P ".$%& 过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因表达的影响 !!""
C M Y K
以 !"! 表示! 组间比较采用单因素方差分析""#$%
&’( )*+,-#或随机区组设计方差分析").+,- "/
0’#1"234$1 5"267$8$ 97"5:%1$!3;#$% #<=>=? 为 差 异
有统计学意义%
! 结 果
!"# 凋亡率测定
@AB%C=D EFGH%I 为用载体携带 JGK%I 的细胞组!
LAM%C=D N J, 为 未 携 带 目 的 基 因 的 空 载 体 组 !
LAM%C=D 为没有携带载体和基因的对照组!用双染法
经流式细胞仪测定!LAM%C=D NJGK%I 组的细胞的凋亡
率明显高于 LAM%C=D NJ, 组和 LAM%C=D 组"表 I$%
!"! 总 $%& 纯度及完整性鉴定
LAMC=D N JGK%I 组 和 未 转 染 LAM%C=D 组 提 取
总 O.- 结果良好! 两组细胞总 O.- 含量均在 C=P
IQ= !; 之间! 琼脂糖凝胶电泳结果分析&GCR O.-
和 ICR O.- 条带清晰! 且两者条带亮度比值大于
I!?R 条 带 模 糊!说 明 O.- 纯 度 和 完 整 性 较 好’图
I$!可满足后续实验需要%
!"’ ()’ 信 号 和 ()* 信 号 计 算 机 叠 加 图 像 处 理
结果
芯片为 GG 行 S GG 列 S TC"亚矩阵$!实验组用
M(D 标记为绿色! 阴性对照组用 M(? 标记为红色%
对于某一点的两种叠加荧光信号!如果 M(D 信号较
强!该点多显绿色"下调趋势$(如果 M(? 信号较强!
该点多显红色)上调趋势$(如果信号强度相似!即
显黄色"图 G$%
!+, -.(/01’ 细 胞 组 和 -.(/02’ 3 4!5/6 细 胞
组杂交信号强度
$轴以实验组 M(D 荧光强度前景值为横坐标!%
轴以阴性对照组 M(? 荧光强度前景值为纵坐标!每一
个数据点代表芯片上一个基因的杂交信号%红色标记
和绿色标记的数据点分别表示 M(? E M(D 的 O’83" 值
UG 和<=V?!属于表达有差异的基因(红色表示表达上
调的基因!绿色表示表达下调的基因(黑色标记表示
O’83" 值在 =V? 和 G 之间!表达基本无差异"图 D$%
表 ! " 组细胞凋亡率比较!!&#"
$%&’( ! )*+,%-.#*/ *0 %,*,1*1.2 -%1(# ./ 3.00(-(/1 2(’’#
4-*5,#
M$77 73#$
LWM%C=D N FGH%I
LAM%C=D N F,
LAM%C=D
-6"68"835 0’8$! "X$
CVT=Y=>ZI’
T>?DY=>[I9
T>ZQY=>TQ9
Z?X 5"#/31$#5$ 3#8$0\’7
[>IG]I=V[C
DV=G][V=?
DVQZ][VIT
’#<=V=I! LAM%C=D E JGK%I \!V LAM%C=D E J, "0 LAM%C=D( 9#U=V=?!
LAM%C=D E J, \!V LAM%C=DV
图 I 总 O.- 琼脂糖凝胶电泳图
K3;^0$ I -;’0"!$ ;$7 $7$580"6_"0$8";0’2 "/ 8"8’7 O.-
‘’#$! I!G! LAM%C=D( ‘’#$! D!T! LAM%C=D N FGH%I>
图 G LAM%C=D N FGH%I 组与 LAM%C=D 组双色荧光叠加图
H3;^0$ G a35"7"0 /7"0$!5$#5$ !^6$06"!383"# 5_’08 "/ LAM%
C=D N FGK%I ’#1 LAM%C=D 5$77!
图 D 基因芯片杂交信号的散点图
K3;^0$ D R5’88$0 67"8 "/ 5b.- 2350"’00’( _(903134’83"# !3;#’7!
严林海!等> FGK%I 过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因表达的影响!!"#
C M Y K
图 ! "#$ 和 %&’() 电泳图
*+,-./ ! &,0.12/ ,/3 /3/$4.1561./41,.07 18 7#$ ,/9/ 09: %&’()
;09/ <! "%=>?@A"7#$#$ ;09/ B! "%=>?@A C )&%7#$&$ ;09/ A! "%=>?@A C DB*><%7#$&$ 309/ !! "%=>?@A%%&’()&$ ;09/ E! "%=>?@A C
)&%%&’()&$ ;09/ F! "%=>?@A C DB*><%%&’()&$ "! 70.G/.H
表 ! 与细胞凋亡相关的差异表达基因
"#$%& ! ’())&*&+,(#%%- &./*&00&1 2&+&0 *&%#,&1 ,3 #/3/,30(0
I3+,1
)B@@@<<JBF
)B@@@@!?B@
)B@@@@J<?J
)B@@@@@!JA
)B@@@@BJEJ
)B@@@@AFK@
)B@@@@B??J
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)B@@@@FJA<
)B@@@@A?E@
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)B@@@<AKF<
)B@@@<!?AE
)B@@@@FF<?
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)B@@@@F?EA
L04+1
BHFE<!
BH!E?<
BH<?FA
BH@!@!
@H!KB?
@H!E?@
@HAKE?
@HAJBE
@HB?<E
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@HBFE<
@HBF!!
@HB@<J
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OLP&(A 5.14/+9
=/33-30. 4-71. 094+,/9 5EA
’.1,.077/: $/33 :/046 ?
O.+TT3/2 617131, A %(.12156+30&
R/U/9 +9 0T2/94+0 617131, B %(.12156+30&
O-71. 094+,/9 ,/9/ T+:
R-.U+U03 7141. 9/-.19 :170+9 $1940+9+9, <
"+41$619:.+03 .+T121703 5.14/+9 RA@
R/.-7 C ,3-$1$1.4+$1+: ./,-304/: G+902/
ST+V-+4+9>0$4+U04+9, /9W#7/ D<=
=192/.U/: 6/3+X>3115>6/3+X -T+V-+41-2 G+902/
O-71. ,/9/ 7#$
T$3>B>0221$+04/: 046091,/9/ B
O-71. 9/$.12+2 80$41. ./$/541. 2-5/.807+3#! 7/7T/. <<T %124/15.14/,/.+9&
!"# 生物信息学分析结果
B< EBB 条 人 类 基 因 表 达 谱 芯 片 检 测 结 果 显
示! 与未转染组 "%=>?@A 细胞相比! 以差异倍数
BH@ 为标准! 检出 "%=?@A C DB*>< 细胞差异表达基
因 J!@ 条!其中与细胞凋亡相关的差异表达基因有
<E 条!其中上调基因 ! 条!下调基因 << 条%表 B&’
!"$ %&’()% 针对性对目的基因的验证
用 O.+W13 一步法分别提取 A 组细胞的总 LM&!
试剂盒纯化后电泳显示 B?R(<?R 条带!ER 条带模糊!
纯化后的总 LM& 作为模板对管家基因 %&’() 进行
’=L 反应! 消化验证效果说明总 LM& 纯度较好!可
满足后续实验需要! 在此基础上对多条基因进行验
证!如 "#$(P;>F(RRL’<(OP"’A(*M<(’ODM’ 其中与
凋亡相关的基因为 "#$!"#$ 的电泳结果及半定量
LO>’=L 的灰度结果 "图 !& 均显示 "#$ 的表达在
"%=>?@A C DB*>< 组 比 "%=>?@A C DY 组 和 "%=>?@A
组下调!验证结果同基因芯片结果一致!其余多条基
因的验证中均表现为与基因芯片表达方向一致’
* 讨 论
DB*>< 是细 胞 周 期 相 关 转 录 因 子 DB* 家 族 成
员 之 一 ! 参 与 组 成 细 胞 核 转 录 因 子 复 合 物
"4.092$.+54+19 80$41. $1753/X&!是细胞凋亡过程中重
要的调控因子’ 本实验结果显示!"%=>?@A C DB*><
组 细 胞 的 凋 亡 率 明 显 高 于 "%=>?@A C DY 组 和
"%=>?@A 组提示 DB*>< 的过表达促进了胃癌细胞
的凋亡’ ;+ 等 )!*研究发现!DB*>< 的过度表达使癌
细胞易于发生凋亡!从而导致肿瘤生长抑制’ 腺病
毒 载 体 介 导 的 DB*>< 基 因 转 移 实 验 模 型 证 明 !
DB*>< 过表达可诱导人胃癌细胞广泛凋亡 )E*’ 我们
的实验结果与这些研究结果的结论一致!但 DB*><
诱导凋亡的机制尚不十分明确’
基因芯片技术是伴随着人类基因组计划发展
起来的一项高通量筛选技术!具有低消耗(高灵敏
严林海!等H DB*>< 过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因表达的影响 !!"#
C M Y K
度的特点!这一崭新的技术已广泛应用在疾病尤其
是肿瘤的基因表达谱分析 "!#!进而成功地应用在肿
瘤相关基因功能研究 ""#$恶性肿瘤的分子学分型 "##$
化疗药物作用及耐药机制 "$#等研究上%本实验中发
现了 %&’() 过表达的胃癌细胞中与凋亡相关的差
异 性 表 达 基 因 )* 条!其 中 上 调 基 因 + 条!下 调 基
因 )) 条% 其中 ,-*. 是重要的广泛认可的肿瘤抑
制基因! 过表达的 %&’() 通过激活肿瘤抑制基因
/)+01’!阻 断 了 ,-*. 的 降 解 !保 证 了 ,-*. 的 稳 定
性和活性 ")2#% 同时!有学者认为!%&’() 的过表达能
够不依赖 -)+01’ 而促进 -*. 蛋白水平升高% 有研究
发现!%&’() 的过表达能够促进 -*. 蛋白水平升高!
这一过程并不伴随 01’ 的表达"))!)&#% 进一步的研究
发现!%&’() 的过表达能够诱使 /*. 的多个氨基酸
残基磷酸化% /*. 的氨基酸残基磷酸化!特别是丝氨
酸 &2 的磷酸化!能够阻止 343& 对 /*. 的结合和降
解 ").#& /*. 的氨基酸残基磷酸化还能够促使 /*. 乙
酰化! 而 /*. 乙酰化能够激活 /*. 结合 560 的活
性!促进细胞的凋亡")+#% 我们的实验结果表明!胃癌
细 胞 %&’() 的 过 表 达 导 致 了 ,-*. 基 因 的 表 达 上
调! 提示 %&’() 通过 ,-*. 依赖性途径促进了胃癌
细胞凋亡的发生%785 是细胞凋亡的又一关键基因!
是对细胞凋亡起抑制作用的 79: 基因家族的一员!
它通过抑制胃癌细胞凋亡而延长胃癌细胞寿命!从
而增加了肿瘤发生的机会并促进肿瘤发展% 785 蛋
白对细胞凋亡具有直接调节的作用!能够抑制许多
因素引起的细胞凋亡!促进细胞的存活")*#%785 可阻
止 凋 亡 形 成 因 子 如 细 胞 色 素 9 和 凋 亡 诱 导 因 子
’;/</=<>?> ?@4ABC4 D;B=<E!08’( 从线粒体内释放出
来!7?4 蛋白表达增加使得凋亡抑制加强% 在我们的
实验结果中!出现了伴随 %&’() 过表达的 785 基因
的表达下调!说明 785 对凋亡的抑制减弱!从而促
进了凋亡的发生% FGB 是同 %&’() 的过表达呈负相
关的凋亡相关基因!是重要的原癌基因!位于染色
体 #H&+!是细胞周期的调节基因!在控制细胞生长$
分化$凋亡和肿瘤的转化中起重要作用% %&’() 的过
表达使得 FGB 的表达下调!而 FGB 正常时维持细胞
的正常生长! 在表达改变时则诱导细胞的凋亡增
加!这也可解释 %&’() 在过表达时胃癌细胞的凋亡
增 加 % 但 伴 随 着 %&’() 的 过 表 达 ! 还 出 现 了
110I9$F0-.J)+$,1805.$-595#$,187.$K80L&
等多个细胞凋亡相关因子的表达变化! 说明 %&’()
还可以通过其他的信号通路调节胃癌细胞凋亡&同
时也提示 %&’() 诱导细胞凋亡的机制复杂!存在多
基因参与和多途径诱导!相互之间还可能构成复杂的
网络% %&’() 在肿瘤组织中的表达国内外学者均有报
道!但对于它们在不同癌细胞或者癌组织及不同组织
分化程度间的表达差异及与肿瘤发生发展的关系!各
家说法不大一致!因此!各凋亡相关基因间的相互作
用在凋亡诱导中的意义尚有待进一步的研究%
!参 考 文 献"
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!编辑及校对#杨允贵"
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