组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制.pdf
组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制.pdf
!癌症" !"#$%&% ’()*$+, (- .+$/%*# 0112# 03$40%&506784069
!基础研究!
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!摘 要 " 背 景 与 目 的 #组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 $"#&:($% ;%+/%:<,+&%& =>?.%抑 制 剂
通 过 抑 制 多 种 基 因 或 蛋 白 介 导 的 信 号 转 导 网 络 的 功 能& 影 响 细 胞 增 殖 及 对 化 疗
药物的敏感性’ =>?. 抑制剂可能会提高紫杉醇 对肺癌细胞的抑制作用’ 本研究
评 价 =>?. 抑 制 剂 曲 古 抑 菌 素 ?$:*#/"(&:+:#$ ?& @A?%协 同 紫 杉 醇 抑 制 肺 癌 细 胞
=B00 及 =5022 的 作 用 及 机 制’ 方 法#将 =B00 和 =5022 细 胞 分 别 分 成 C 组#$5%
对 照 组($0%紫 杉 醇 组$@?D%($B%@A? 组($C%以 @A? 预 先 作 用 50 " 后&再 使 用 紫
组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对
人肺癌细胞株抑制作用及机制
张 东 5" 刘长庭 5" 于晓妉 0" 刘 岩 5
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5E 解放军总医院南楼
呼吸科"
北京 4773FB
0G 解放军军事医学科学院
基础所"
北京 4773F7
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通讯作者# 张 东
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@%,G# 39G74BF04024929
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基 金 项 目 #军 队 $十 一 五 %面 上 课
题 P 类
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U,+$% A)*-+/% U*(V%/: .,+&& P
收稿日期#0772S79S57
修回日期#0772S73S76
!"#$
C M Y K
张 东!等! 组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制
组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 !"#$%&’( )*+,*%-.+$*"
/012#抑制剂是一类新型的$对多种肿瘤具有抑制
功能的制剂"通过抑制多种基因或蛋白介导的信号
转导网络的功能"影响细胞的增殖及对化疗药物的
敏感性% 3012 抑制剂的诸多功能使其联合其他治
疗方法成为新的治疗思路% 我们检测 3012 抑制剂
451 联合紫杉醇对肺癌细胞的协同抑制作用" 期望
为临床应用提供理论基础%
! 材料与方法
!"! 材料
人 肺 癌 细 胞 株 3678$398:: 由 军 事 医 学 科 学
院 惠 赠 % 四 甲 基 偶 氮 唑 蓝 &;44#$ 二 甲 基 亚 砜
&0;5<#均为 5#=>? 公司产品’兔抗人总 @AB 多克
隆 抗 体$鼠 抗 人 磷 酸 化 @AB&C@AB#多 克 隆 抗 体$
鼠抗人 D1AD 单克隆抗体$ 鼠抗人 !E?,%#’ 单克隆
抗 体 $ 鼠 抗 人 5FGH#H#’ 单 克 隆 抗 体 为 美 国 2*..
5#=’?.#’= 公 司 产 品 ’I21 蛋 白 测 定 试 剂 盒 为 美 国
D#*G,* 公司产品’ 紫杉醇为美国 5#=>? 公司产品’
451 为美国 2?.I#&,"*> 公司产品%
!"# 方法
JK7KJ 细 胞 培 养 3677$3J7:: 细 胞 常 规 培 养 于
高糖 0;@; 完全培养液中 &含 JLM胎牛血清"9LL
F N >O 青霉素"9LL F N >O 链霉素#"经 LP8QM胰蛋白
酶溶液消化传代"在 RST$饱和湿度$含 QU V<7 的
培养箱中进行培养%
JK7K7 ;44 实 验 取 对 数 生 长 期 的 细 胞" 以 JW
JLX N 孔接种于 YZ 孔板中" 培养过夜后将两种细胞
分 为 紫 杉 醇 YZ " 组 &4[\#$45[ J7 " 组 &45[#和
45[ 作用 J7 " 再加紫杉醇 ]X " 组&4^#"J7 " 时换
培养液% 联合用药时 45[ 浓度为 6__ ’>&. ‘ O"紫杉
醇 浓 度 梯 度 为 _K__J$_K_J$_KJ$J$J_$J__$J___
’>&. ‘ O’变 换 用 药 时 "以 吸 管 吸 出 原 培 养 液 "DI5
缓 冲 液 7__ "O 洗 涤 一 次" 再 加 入 相 应 浓 度 的 药
物%451 浓度梯度为 J]Kab$6aKb$ab$Jb_$6__$Z__$
J 7__ ’>&. ‘ O’J7 " 时换为空白培养液% 每组设 6
个复孔"同时设正常和空白对照组% 置 :Z 孔板于
培养箱中共培养 :Z "% 按常规方法依次加入 ;44
溶液$裂解液"振荡 后 测 吸 光 度 值 &! 值 #% 并 按 下
式 计 算 细 胞 存 活 率(存 活 率c!处 理 组 ! 值 ‘ 阴 性
对 照 组 ! 值)WJ__U%采用曲线回归模型拟合其量
效 关 系 " 得 到 各 时 段 451 作 用 的 半 数 抑 制 浓 度
!d2b_)% 实验重复 6 次%
JK7K6 流式细胞仪分析细胞周期及检测凋亡率
取对数生长期的细胞" 以 JWJ_X ‘ 孔接种于 Z 孔板
中"当 细 胞 生 长 至 Z_U密 度 时"分 为 正 常 对 照 组$
紫杉醇 7X " 组!41\)$451 J7 " 组!451)$451 作
用 J7 " 再加紫杉醇 7X " 组!4^)X 组% J7 " 时换培
养液% 451 用药浓度为 6__ ’>&. ‘ O"紫杉醇用药浓
度为 J_ ’>&. ‘ O% 按分组时间到期时分别用 _K7bU
胰蛋白酶溶液消化收集细胞"J ___ G ‘ >#’ 离心 J_
>#’"DI5 洗 7 次"重悬细胞于 _KZ >O 的 DI5 液!含
JU胎 牛 血 清 )"加 入 JKX >O 冷 乙 醇 "混 匀 固 定 "
e7LT保存% 检测当天离心"DI5 液洗 7 次"重悬细
胞 于 LPb >O 的 DI5" 加 入 b "O Af?$*"6aT水 浴
6_ >#’"再加 J >= ‘ >O 碘化丙啶!Dd)b_ "O"避光"
室温 7_ >#’"上机检测% 实验重复 6 次%
JK7KX 荧光显微镜观察细胞核形态变化 取对数生
长期细胞接种于 Z 孔培养板" 每孔加入 JWJ_b 个细
胞"培养液 7 >O"按 JK7K6 的分组"分组时间到期后"
按 JgJ LLL 的终浓度加入 3&*,"$%666X7"于 6ST$饱
和湿度$含 bU 2<7 的培养箱中反应 7L >#’"荧光显
微镜下紫外光激发 3&*,"$%666X7 呈蓝色"7L 倍显微
镜下观察拍照"同时摄取普通光镜下照片%
JP7Pb h*$%*G’ i.&% 检测蛋白表达 总细胞外信号
调节激酶及其磷酸化蛋白!%&%?. ?’) C"&$C"&G-.?%#&’
杉醇的联 合 用 药 组!4^)% 分 别 以 ;44 法$流 式 细 胞 术 检 测
细 胞 增 殖 情 况 以 及 细 胞 周 期$ 细 胞 凋 亡 等 指 标 的 变 化 "荧
光 显 微 镜 观 察 细 胞 核 形 态 的 改 变 "h*$%*G’ i.&% 检 测
5FGH#H#’$D1AD 蛋 白 及 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 !@AB) 的 表
达% 结 果 !451 明 显 增 强 了 紫 杉 醇 对 两 种 肺 癌 细 胞 的 抑 制
率%紫 杉 醇 作 用 :Z " 对 3677 细 胞 的 d2bL 由!XjPLak7ZKJ7)
’>&. ‘ O 下 降 至 !ZK6XkbKS7)’>&. ‘ O" 对 3J7:: 细 胞 的 d2b_
由 !JJ_KZ k6jKS)’>&. ‘ O 下 降 至 !Z6KS kJJKj)’>&. ‘ O" 差 异
具 有 统 计 学 意 义!"l_K_b)% 4^ 组 3677 细 胞 凋 亡 率 较 41\
组 明 显 增 加 !"l_K_b)’ 各 组 3J7:: 细 胞 出 现 少 量 凋 亡 细
胞 "4^ 组 的 死 亡 细 胞 明 显 多 于 其 他 组 % 41\ 上 调 3677 细
胞 中 C@AB 的 表 达 "451 及 4^ 减 低 两 种 细 胞 中 C@AB 表
达 ’41\ 明 显 增 加 5FGH#H#’ 的 表 达 "451 及 4^ 下 调 了
5FGH#H#’ 的 表 达% 41\ 组 和 4^ 组 3677 细 胞 中 均 检 测 到 剪
切 D1AD 蛋 白 "4^ 组 较 41\ 组 剪 切 D1AD 蛋 白 明 显 增 加 "
而 3J7:: 细 胞 各 组 均 未 检 测 到 剪 切 D1AD 蛋 白 % 结 论 !
3012 抑 制 剂 451 联 合 紫 杉 醇 可 以 协 同 抑 制 3677 及
3J7:: 细 胞 增 殖"促 进 3677 细 胞 凋 亡 和 3J7:: 细 胞 死 亡%
协 同 机 制 可 能 与 通 过 下 调 肺 癌 细 胞 由 紫 杉 醇 诱 发 的
5FGH#H#’ 高 表 达 和 阻 断 @AB 通 路 的 激 活 有 关 %
关 键 词 !肺 癌 ’ 组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 ’ 曲 古 抑 菌 素 1’ 紫 杉
醇’ 细胞凋亡’ 细胞外信号通路激酶
中图分类号!AS6E6 文献标识码!1
文章编号!J___mXnS\!7__:)J7mJ7S_m_S
!"#!
C M Y K
!"#$%&!’’(’%$ )*+,%’ $-.(’%/-0 12,%)-! /345 %,0
6785"#人多聚 9:; 核糖 聚 合 酶$<(=%, ;>?@ 9:A
$*B>)- 6>?@=-$%)-!A98A"以及 C($D*D*, 蛋白的表达%
按 EFGFH 的 分 组!分 组 时 间 到 期 后!用 三 去 污
试剂提取总蛋白! 用 I$%0J>$0 方 法 测 定 蛋 白 质 浓
度& 等量蛋白质分别采用 C:CK聚丙烯酰胺凝胶垂
直电泳进行分离!然后转至 AL:M 膜上!NO牛奶室
温下摇动封闭后加入一抗!PQ过夜! 室温下洗膜
后 加 入 二 抗 !用 7RS ;STC ’9=-$)<%="进 行 发 光
显影&
!"# 统计学方法
应用 C;CCEEFU 统计软件处理数据! 采用单因
素方差分析’V,-WX%@ 9YVL9"作各组间差异的显
著性检验! 并对部分指标进行相关性分析! 以 !Z
UFUN 为 检 验 水 准 & 应 用 中 位 效 应 分 析 法 ’=-0*%,
-JJ-&/ %,%’@)*)"的联合指 数’&>=B*,%/*>, *,0-"! R["
法来判断 (E)* R[\E 表示协同!R[]E 提示拮抗!R^ZE
表示附加作用& 如果曲线上多于两点以上 R^\E 表
示协同!提示两种药物的作用是协同&
$ 结 果
$"! %&’( 抑 制 剂 )*’ 对 体 外 培 养 细 胞 的 增 殖
抑制作用
_C9 与紫杉醇联合应用后!从抑制曲线上看!
_C9 明 显 提 高 了 紫 杉 醇 对 ‘HGG 和 aEGbb 细 胞 的
抑 制 水 平!紫 杉 醇 对 aHGG 细 胞 的 ^RNU 由 ’PcFUde
GfFEG" ,=>’ g S 下降至’fFHPeNFdG" hij? g k!差异有
统计学意义’!\UFUN"& 紫杉醇对 ‘EGbb 细胞的 [RNU
由 ’EEUFf eHcFd" hij? g k 下 降 至 ’fHFd eEEFc"
hij? g k!差 异 有 统 计 学 意 义’!\UFUN"& 根 据 R[ 方
法分析!两种细胞 _M 组抑制曲线的各点 R[ 值均\
E!提示 _C9 联合应用紫杉醇达到了协同效应& 两
组细胞的生长曲线见图 E!G&
$"$ )*’ 对 %#$$!%!$++ 细胞周期及凋亡的影响
_C9 作用 ‘HGG 及 ‘EGbb 细胞 EG < 后! 与对
照组相比细胞周期无明显变化& 紫杉醇作用 GP <
后!lG g m 期 ‘HGG 细 胞 较 对 照 细 胞 显 著 增 加 ’!\
UFUN"! 同时伴有细胞凋亡+_M 组较对照组及 _C9
组 lU g lE 期细胞减少! 而与 _9n 组相比则是明显
lU g lE 期细胞阻滞! 细胞凋亡数较 _9n 组明显增
加’!\UFUN"!见表 E 和图 H& _9n 及 _M 组中 lU g lE
期 ‘EGbb 细胞较对照细胞明显增加’!\UFUN"!lG g
o 期及 C 期细胞较对照细胞明显减少’!\UFUN"!P
组细胞凋亡率均较低!见表 G 及图 P&
图 G _C9 作 用 EG <!_9n 作 用 bf < 及 联 合 作 用"_C9 EG
<# _9n cP <$后 ‘EGbb 细 胞 增 殖 情 况
M*+($- G ;$>?*J-$%/*>h &($D- >J ‘EGbb &-??) /$-%/-0 p*/<
_C9 %/ EG <! _9n %/ bf <! %h0 &jiB*h-0 %&/*jh ’_C9 EG
< /<-h _9n cP <"
9BB$-D*%/*jh) %) *h M*+($- EF
Rjh/$j?
_C9
_9n
_M
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.8.6" P"M13%FIN OF$B P"I$%"H N%"J1 OF$B 4FNIFRFP3I$ T5P%53458
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图 7 流式细胞仪检测各组 V799 细胞的凋亡情况
,FNJ%5 7 ,H"O PW$"M5$%FP 3I3HW4F4 "R 53PB N%"J1 "R V799 P5HH4
图 ; 流式细胞仪检测各组 V09>> 细胞凋亡情况
,FNJ%5 ; ,H"O PW$"M5$%FP 3I3HW4F4 "R 53PB N%"J1 "R V09>> P5HH4
张 东!等8 组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制
对 照 组 V799 和 V09>> 细 胞 核 为 圆 形% 椭 圆
形"少 量 呈 半 月 形$’A) 组%紫 杉 醇 组 及 联 合 应 用
组 V09>> 细胞核多呈偏心性改变" 细胞核呈马蹄
铁 样 改 变"伴 有 多 核%空 泡 变 性 等 死 亡 象"只 有 很
少 的 凋 亡 小 体 & ’, 组 较 其 他 组 有 更 多 的 细 胞 死
亡& 在 V"5PB4$777;9 染色下"’)X 及 ’, 组可见较
多 V799 细胞破碎及凋亡小体"’A) 组有少量凋亡
小体& 见图 6&
!"# $%& 对 ’() 及 %*+,-,-. 蛋白表达的影响
将 正 常 组 和 ’)X 组 的 1YZ[ 表 达 水 平 分 别
与 相 应 组 的 $YZ[ 进 行 比 较 "V799 正 常 组
1YZ[ / $YZ[ 为 089<"’)X 组 1YZ[ / $YZ[ 为 08;9"
提 示 ’)X 应 用 后 V799 1YZ[ 蛋 白 表 达 略 有 增
加 $V09>> 正 常 组 1YZ[ / $YZ[ 为 .8;6"’)X 组
1YZ[ / $YZ[ 为 .897"1YZ[ 蛋 白 表 达 下 降 & ’A)
的 单 独 应 用 下 调 了 V799%V09>> 细 胞 中 1YZ[
蛋 白 的 表 达 水 平 & ’, 组 明 显 抑 制 1YZ[ 蛋 白 的
表 达 "V799 及 V09>> 细 胞 均 较 ’)X 组 下 降 & 见
图 <&
’)X 作 用 9; B 后 V799 及 V09>> 细 胞 中
AJ%UFUFI 蛋白的表达均增加"分别是正常对照组的
08@0 倍%08<0 倍$’A) 下调 AJ%UFUFI 蛋白的表达"分
别是对照组的 @=\%;<\& ’A) 联合 ’)X 应用明显
下 调 了 由 ’)X 引 起 的 AJ%UFUFI 蛋 白 的 高 表 达 "
AJ%UFUFI 蛋 白 表 达 水 平 分 别 是 ’)X 组 的 60\ %
77\& 见图 <&
’)X 和 ’, 组均检测到 ])Z] 蛋白表达"’, 组
较 ’)X 组 ])Z] 蛋白明显增强$ 而 V09>> 各组均
未检测到剪切 ])Z] 蛋白& 见图 <&
!"#$
C M Y K
! " # $
% & ’ (
图 ) 各组细胞核形态的变化!(*+,-./ 00012324"
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张 东!等P 组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制
! 讨 论
化疗是治疗肿瘤的主要方法# 但由于耐药率
的上升#化疗的有效率一直不尽如人意% 近年的研
究 发 现 #($!# 抑 制 剂 可 以 通 过 抑 制 信 号 转 导 网
络# 影响细胞增殖及细胞对化疗药物的敏感性 &2’%
($!# 抑制剂联合化疗可能会减少化疗的耐药率#
提高化疗的有效率% &75@* 等 &C’应用 ($!# 抑制剂
Q!RS21 与多种化疗药物同时作用于乳腺癌细胞#
发现 Q!RS21 可以增强紫杉醇(吉西他滨等化疗药
物诱导的细胞凋亡# 提高乳腺癌细胞对化疗药物
的敏感性% T<;@5.-5 等 &1’的研究显示#($!# 抑制剂
都可以增加紫杉醇致肿瘤细胞死亡作用% 本研究
结果显示#($!# 抑制剂 KL! 与紫杉醇联合应用#
能 提 高 紫 杉 醇 对 肺 腺 癌 细 胞 (F2GG 及 (C22 的 抑
制率#使紫杉醇对两种细胞的 T#)E 明显下降#提高
对这两种细胞的抑制敏感性% 但联合用药后紫杉
醇对两种细胞的 T#)E 下降程度却不同#对 (C22 细
胞的 T#)E 下降约 U 倍#而对 (F2GG 细胞下降 2 倍#
这一结果提示联合用药会因细胞特性的不同而产
生不同效果%
($!# 抑 制 剂 通 过 引 起 细 胞 周 期 阻 滞 和 诱
导 细 胞 凋 亡 达 到 抑 制 肿 瘤 生 长 的 目 的 % 不 同
($!#抑 制 剂 作 用 于 不 同 细 胞# 会 出 现 不 同 的 细
胞 周 期 改 变 % ":;6*.M:*@@> 等 &)’ 的研 究 显 示#KL!
和丁酸导致 !)1G 细胞阻滞于 ’F 期#而 $V 则导致
!)DG 细胞周期阻滞于 ’2 W X 期% 本研究结果显示#
KL! 导 致 (F2GG 和 (C22 细 胞 周 期 阻 滞 于 ’F 期#
较单独用药更为复杂的是# 联合用药后的细胞周
期改变% KL! 与紫杉醇联合应用后#在 (F2GG 细胞
维持或增加了 ’F 期阻滞# 而在 (C22 细胞则出现
’2 及 L 期的阻滞$ 紫杉醇主要在 ’2 期发挥功能#
’F 期 阻 滞 相 对 减 少 了 紫 杉 醇 作 用 的 靶 细 胞 数#因
此 ’F 期的细胞阻滞可能会影响紫杉醇的药物敏感
性% 在本研究中# 我们所检测的细胞周期变化是
CY - 内的早期变化# 结合细胞生长抑制曲线的结
果# 早期 ’F 期的阻滞并不会降低紫杉醇的细胞生
长 抑 制 能 力 # 因 为 ($!# 抑 制 剂 诱 导 ’F 期 的 阻
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C M Y K
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