血管内皮生长因子过表达对肺癌生成及转归的影响.pdf
血管内皮生长因子过表达对肺癌生成及转归的影响.pdf
论 著 癌症进展杂志 。 期 101
0NCOL0GY PROGRESS 209 7 N0 1 ．Jl曲 ．V0L ． ．
血管内皮生长因子过表达对肺癌
生成及转归的影响
穆海玉孝 沈春燕 陶 盟
天津武警医学院附属医院肿瘤中心，天津 300162
摘要 目的 研究血管内皮生长因子 (VEGF)在非小细胞肺癌的阳性表达影响肺癌
进展和预后的作用机制。方法 应用免疫组化 SABC染色法检测40例原发性支气管肺癌
标本中 VEGF的阳性表达、微血管密度 (MVD)计数，评价 VEGF和 MVD的关系、
VEGF与非小细胞肺癌临床病理参数之间的关系。结果 VEGF在非小细胞肺癌组织中呈
现阳性高表达，其含量及阳性表达与肿瘤大小和淋巴结转移密切相关。肿瘤直径越大、
已有淋巴结转移，则VEGF含量和表达越高。在VEGF表达阳性的癌组织中MVD值明显
高于VEGF阴性表达的肺癌组织，差异具有统计学意义。结论 VEGF通过调节和诱导肺
癌微血管的生成而促进非小细胞肺癌的发展，它可作为评估非小细胞肺癌恶性程度、淋
巴结转移潜能和预后的重要监测指标之一。
关键词 非小细胞肺癌 血管内皮生长因子 微血管密度 血管生成
中图分类号 R734．2／R730．7 文献标识码 A
Efect of VEGF on the progression and the prognosis in lung cancer
Mu Haiyu Shen Chunyan Tao Meng
Cancer center，the Afiliated Hospital，Armed Police for Medical Colege，Tianjin 300162，China
Objective To explore the positive expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in non．
small cell lung cancer． Methods VEGF po sitive expression were detected by immuno histochemistry and im-
age an alysis technique． Results The VEGF positive expression was mainly located in the cytoplasm of lung
cancer．Th e positive rate of VEGF in non—smal cell lung cancer was sigIlifcantly higher than that in non—lung
cancer．Th e VEGF positive expression level increased along with the increase of tumor size and metastasis lev．
e1． Microvascular density was notably higher in the tissue specimens of VEGF po sitive expression
． Conclusion
VEGF play al important role in the growth and metastasis of non．small cell lung cancer．
Key words non—small lung cancer VEGF MVD neovascularization
Oncol Prog，2009，7 fI)
通讯作者 (Coresponding author)，e—mail：kejutianjin@163．com
善 囊 曩 仉
102 癌症进展杂志2009年 1月第 7卷第 1期 ONCOLOGY PROGRESS，Jan 2009，V01．7，N0．1
肺癌是当今世界上对人类健康和生命危害
最大的恶性肿瘤，随着传统化疗进入了平台期，
靶向治疗逐渐进入人们的视野。实验显示新生
血管生成是肿瘤生长与转移的解剖学和生理学
基础，因此研究可能影响肺癌血管生成的因素：
寻找有效的抗血管生成药物，可望在很大程度
上改变肺癌治疗的现状。肿瘤细胞能够分泌多
种生物活性物质，直接或间接作用于血管内皮
细胞，促进血管的生长与形成。研究显示，血
管内皮生长因子 (vascular endothelial growth fac-
tor，VEGF)为肺癌血管生成的最关键因素。本
实验采用SP免疫组织化学方法，检测肺癌组织
中VEGF的阳性表达，分析研究它与微血管密
度 (microvessel density，MVD)之间的关 系及
与临床病理、组织分型和转移之间的联系，以
探讨VEGF在肺癌血管生成中的作用。
I1 对象和方法
1．1 对象
1．1．1 主要实验药品 (购自武汉博士德生物工
程有限公司) ①兔抗人血管内皮生长因子多
克隆抗体 (即用型)；②兔抗人第八因子相关抗
原多克隆抗体 (即用型)；③ HIGH—SABC试
剂盒：正常山羊血清封闭液、生物素标记的二
抗山羊抗兔 (IgG)、HIGH—SABC(链酶亲和
素——过氧化物酶复合物)、复合消化液及抗原
修复液；④DAB显色试剂盒；(~)APES粘片剂。
1．1．2 研究对象及分组 所有对象均来 自2002
年 1月 ～2003年 12月我院住院及门诊经手术或
纤支镜检查获得的肺组织石蜡标本。
1．1．2．1 肺癌组：共 40例，年龄 28～72岁，
平均年龄52．6岁，其中男21例，女 l9例。所
有患者术前均未接受化疗、放疗及其他抗癌治
疗，所有标本均重新切片后经 HE染色证实为
肺癌。组织学分类参照 WHO (1981年)标准，
其中鳞癌21例，腺癌14例，小细胞未分化癌5
例；高分化2O例，中分化7例，低分化 8例；
临床分期依照 1997年国际抗癌联盟 (UICC)
修订的标准进行分期，其中 I期 +Ⅱ期 21例，
Ⅲ期 +Ⅳ期 14例。
1．1．2．2 肺良性病组：共12例，男9例，女3
例；年龄28～70岁，平均年龄 49．8岁。标本
重新切片后经HE染色证实7例为结核球、5例
为肺炎。
1．1．2．3 正常对照组：共 10例，男6例，女4
例；年龄34—68岁，平均年龄47．6岁。经HE
染色证实为正常肺组织。
1．2 方法
采用SABC免疫组织化学染色法，所有石蜡
标本均行5切片，连续切4片，置6o度烤箱内烤
3O分钟。所有切片分别经二甲苯脱蜡，无水酒精
及其他不同浓度酒精脱苯，自来水洗 2分钟水
化。1张切片行 HE染色核实病理诊断，其余切
片行 SABC染色，按药盒操作规程进行。以PBS
代替一抗作阴性对照，用武汉博士德生物工程有
限公司提供的已知阳性切片作阳性对照。
1．3 结果判定
1．3．1 VEGF表达的判定标准 用 SABC免疫组
化染色法，镜下细胞浆呈棕黄色颗粒状为阳性，
细胞浆呈透明或无色者为阴性，切片中观察5个
高倍视野 (200×)，每一视野记数 100个细胞，
阳性染色细胞 <5％为阴性，≥5％为阳性。
1．3。2 MVD的测定 参考 Weidner方法，先在
低倍镜 (40×)下扫视整个切片，确定对 FIU
Ag明显着棕褐色微血管密度最高区，即所谓
“热点区”。然后换成高倍镜 (200×)进行计
数。凡在肿瘤组织中与邻近微血管、肿瘤细胞
及其他结缔组织分界清楚的任何 1个染成棕褐
色的细胞或细胞簇均被认为是 1个血管；只要
结构不相连，其分枝结构也算作 1个血管。但
不能用有无红细胞的出现及是否形成管腔来计
数血管数。已形成明显肌层的血管不参与计数，
结果以3个视野血管的均数表示。
1．4 统计学处理
计量资料数据采用 i±s表示，所得数据采
用t检验和方差分析；计数资料采用 x 检验。
I2 结果
2．1 肺组织中MVD分布情况
2．1．1 3种肺组织中 MVD分布情况 阳性染
论 著
0NCOLOGY PROGRESS，Jan 2009，VoI．7，No．1 癌症进展杂志2009年 1月第7卷第 1期 103
色局限于血管内皮细胞膜，呈棕褐色，形成条
纹 (纵切面)或 (环状横切面)血管结构。微
血管形态不规则，有些已成管腔结构，有些只
见内皮细胞呈点状分布。微血管在癌组织中的
分布呈异质性，大多集中在肿瘤边缘，癌巢及
癌细胞密集区MVD显著少于癌周区域及增生活
跃区域。肺癌组织 MVD显著高于肺良性病变和
正常组织；而肺良性病变和正常组织的 MVD差
异无统计学意义 (表 1)。
2．1．2 非小细胞肺癌中MVD表达与临床病理
MVD与原发肿瘤大小、组织学分级、淋巴转
移有关，而与病理分型无关 (表3)。
2．2 VEGF在肺组织中的表达
2．2．1 VEGF在 3种肺组织中的表达 VEGF
阳性着色为棕黄色颗粒，主要分布于肿瘤细胞
浆中，在肿瘤细胞坏死灶周围尤为明显。阳性
肿瘤组织内及邻近基质组织内的血管也有不同
程度的着色。肺癌组 织 中 VEGF阳性率 为
62．50％ (25／40)，显著高于肺 良性病变组织
16．67％ (2／12)及正常对照组织 (0／10)，差异
有统计学意义；肺良性病变组织及正常对照组织
的VEGF阳性率差异无统计学意义 (表2)。
2．2．2 非小细胞肺癌中VEGF表达与临床病理
(表 3)
表 1 MVD在3种肺组织中的表达
表2 肺组织 VEGF蛋白的表达
表 3 非小细胞肺癌 MVD、VEGF表达与临床病理参数之间的关系
临床病理特征 VEGF N MVD p
4- 一
肿瘤大小
≤5
>5
组织学分级
高
中
低
病理分型
鳞癌
腺癌
淋巴结转移
有
无
17．16±4．Il
25．63±4．77
17．35±4．22
23．14±4．38
28．25±4．20
20．24±56．1
22．21±6．74
26．62±4．58
17．73±4．13
0．0o0
0．023
0．72
10
14
13
5
7
13
11
12
12
0．629
0．897
9 2 7 2 1 8 3 1 K
加 7 M
104 癌症进展杂志2009年 1月第7卷第 1期 ONC0L0GY PRoGflES．Jan 2(J09，v0J．7，No．1
2．2．3 肺癌组织中VEGF表达与MVD(表4)
表4 肺癌 VEGF表达与 MVD
VEGF MVD 值
讨 论
肿瘤是代谢高度旺盛的细胞，在肿瘤发生
的早期，肿瘤细胞可通过组织渗透而维持其生
长，此期肿瘤成为高增生和高凋亡平衡的休眠
状态肿瘤．肿瘤生长和转移过程中不断有新生
血管的出现，当肿瘤直径达到或超过 1～2ram
时，经微循环渗透提供的营养物质已不能满足
肿瘤的生长需要，此时，向肿瘤提供营养物质
的血管逐步形成，这种由宿主组织血循环形成
的毛细血管网最终进入肿瘤组织，血管新生是
肿瘤生长与发展的必经之路，与实体瘤的发生
和转移有着密切的关系 ’3．4，̈J。应用特异性抗
体标记肿瘤组织血管内皮细胞，计数单位面积
中的微血管数 目，即为微血管密度 (MVD)，
可由此来衡量肿瘤血管生成的活跃程度。资料
显示，非小细胞肺癌瘤内MVD明显增高，且与
预后显著负相关 J。本试验显示，微血管在癌
组织中的分布呈异质性，大多集中在肿瘤边缘，
癌巢及癌细胞密集区 MVD显著少于癌周区域及
增生活跃区域。肺癌组织 MVD显著高于肺良性
病变和正常组织 (P<0．01)；肺良性病变和正
常组织的MVD差异无统计学意义 (P>0．05)，
通过比较不同病理状态下 MVD，我们发现肿瘤
的血管生成影响着非小细胞肺癌的进展，与原
发肿瘤的大小、淋巴结转移状态、肿瘤的分化
程度密切相关，是评估和判断肺癌血管生成状
态的独立、相关性良好的指标，由此进一步证
实了上述观点。肺癌血管生成过程受诸多因素
调节，其中功能最强、作用最直接的是 VEGF。
VEGF是 目前已知的最关键的血管生成因子。
1989年Ferara等 在牛垂体滤泡星状细胞体外
培养液中首先将其纯化出来，因发现它有促血
管内皮细胞有丝分裂的活性，称其为血管内皮
生长因子／血管通透因子，VEGF是一种同源二
聚体糖蛋白，是目前已知的最关键的血管生成
因子，肿瘤能够特异性的与血管内皮细胞膜上
的受体结合，刺激内皮细胞的分裂、增殖、迁
移，促毛细血管绊形成并向瘤体内延伸，使肿
瘤内微血管数量增加，满足肿瘤对代谢 的需
要 -4]。Ellis等 认为，肿瘤细胞要完成淋巴
结转移与转移灶中血管生成密切相关，这个过
程由VEGF调节。VEGF信号传导通路在肿瘤的
血管生长调控中非常重要，国内外许多实验都
通过干扰这个通路来研究调控肿瘤的血管生长。
一 些研究发现，无论是在体外培养的肿瘤细胞、
动物模型，还是人体许多肿瘤组织包括肺癌和
癌灶周边支气管粘膜上皮细胞、浆液腺及肺泡
上皮细胞中均有 VEGF的高表达，肺癌组织
VEGF表达的阳性率、阳性细胞数和染色强度
均高于癌旁正常组织 -9]。VEGF的过表达促使
肺癌组织新生血管增加，而肿瘤新生幼稚血管
的结构缺乏完整性，管壁仅排列一层内皮细胞，
并且由于缺乏平滑肌，基底膜变薄或消失缺如，
肺癌细胞易于侵蚀血管，使肿瘤细胞极易脱离
母体进入血管，造成肺癌的血行转移。Yuen和
Salven等 0̈1“ 通过对手术切除的肺癌患者 VEGF
表达高低的测定以及术后生存率的观测发现，
肺癌患者中 VEGF高表达者的术后生存时间较
短，且较早复发。另外一些研究也显示：肺癌
组织血管新生与患者的生存期密切关联，呈十
分良好的相关性，提示 VEGF不但是促进肺癌
组织血管生成的关键因素，也是预测肺癌患者
预后的指标。Matuyama等 ̈通过研究发现，肺
癌组织 VEGF表达阳性患者生存期明显短于表
达阴性者，VEGF可作为判断肺癌患者预后的
独立指标。本研究检测4O例肺癌患者组织标本
显示，VEGF阳性着色为棕褐色颗粒，主要分
布于肿瘤细胞浆中，在肿瘤细胞坏死灶周围尤
为明显。阳性肿瘤组织内及邻近基质组织内的
血管也有不同程度的着色。癌组织中 VEGF阳
性率为62．50％ (25／40)，显著高于肺良性病
0NCOLOGY PROGRESS，Jan 2009，V01 7，N0．1 癌症进展杂志2009年 1月第 7卷第 1期 105
变组织 16．67％ (2／12)及正常对照组织 (P<
O．01)；肺 良性病变组织及正常对照组织 的
VEGF阳性率差异无显著性 (P>0．05)。通过
评价VEGF表达与临床病理的关系发现，肿瘤
直径 >5cm组 VEGF阳性率为 87．50％ (14／
16)，与肿瘤直径 ≤5cm 组 52．63％ (10／19)
相比差异有统计学意义(P<0．05)。淋巴结转
移组VEGF阳性率为92．31％ (12／13)，与无淋
巴结转移组 54．55％ (12／22)，相比差异有统
计学意义 (P<0．05)。本实验结果表明，在非
小细胞肺癌 中，VEGF与原发肿瘤 的大小、淋
巴结转移状态密切相关，与肿瘤的分化程度、
病理分型无关 (P>0．05)。为进一步确定
VEGF与肺癌组织血管新生的关联性，我们分
析了不同VEGF表达的组织中MAD的表达，发
现VEGF阳性高表达组MAD计数显著增高，而
VEGF低表达组 MAD较低，两者差异具有统计
学意义 (P=0．012)，说明VEGF与 MAD之间
确实存在正相关的密切关系，进一步验证 了
VEGF是通过促使肺癌新血管生成而影响肺癌
的发展和预后，VEGF是肺癌治疗极其重要新
靶点的理念。
综上所述，MVD是评估和判断肺癌血管生
成状态的独立、相关性良好的指标；VEGF在
肺癌组织中呈现 阳性过表达，VEGF表达与
MVD具有良好的相关性；VEGF表达与非小细
胞肺癌肿瘤直径，淋巴结转移密切相关，而与
肿瘤的分化程度、病理分型无关。因此 VEGF
通过促使血管新生成而影响非小细胞肺癌的发
展和预后，VEGF的靶向治疗将通过阻断肺癌
血管的生长而控制非小细胞肺癌的侵袭和远处
转移。
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