Stathmin siRNA表达载体的构建及对LM8细胞生物学行为的影响.pdf
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中国癌症杂志
CHINA ONCOLOGY
2009年第19卷第1期
2009 Vo1．19 No．1
Stathmin siRNA表达载体的构建及对
LM8细胞生物学行为的影响
≯
_ 车彪 邵增务 杨述华 刘勇 一 ． _0 0
髻
j 华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北武汉430022 l1．。 0
[摘要 ] 背景与目的：stathmin在多种恶性肿瘤细胞中都有高水平表达，通过抑制其表达可以干扰恶
性肿瘤细胞的分裂，影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。本研究构建并观察stathmin基因RNA干扰表达载体转染LM8
细胞系后对stathmin表达及细胞生物学行为的影响。方法：构建靶向stathmin干扰质粒pGenesi卜卜Stathmin
和通用对照质粒pGenesi1卜HK，以脂质体法142个重组质粒分别转染骨肉瘤I M8细胞系。实时荧光定量PCR~I
Western 印迹技术检测各组LM8细胞系stathmilq在mRNA~I蛋白水平的表达，MTT(噻唑蓝)法比色分析检测细
胞体外生长抑制率，软琼脂集落形成实验观察单个细胞体外增殖活力，细胞HE染色观察细胞形态学的变化，
Hoechst染色观察细胞凋亡特征并计算凋亡率，流式细胞术定量分析细胞周期变化，C3Hd~鼠移植瘤实验显示肿
瘤细胞成瘤能力。结果：DNA 测序证实成功构建pGenesi卜卜Stathmin重组质粒。转染LM8细胞后，明显抑制
stathmin基因表达；细胞体外生长抑制率显著增加；单个细胞体外增殖活力显著下降；细胞HE染色部分细胞
呈典型的凋亡细胞形态学改变；Hoechst染色显示细胞凋亡特征，细胞凋亡率明显高于对照组；流式细胞术检
测显示细胞周期阻滞于G。／M期，明显高于对照组；C3td,鼠移植瘤实验显示特异转染组致瘤率下降，肿瘤生长减
缓。 结论：成功构建的靶向干扰质粒pGenesi卜卜Stathmin能有效抑制stathmin基因在骨肉瘤LM8细胞的表达
并影响其相关生物学行为，其抑制骨肉瘤细胞的增殖与生长，为stathmin基因应用于骨肉瘤的基因治疗研究奠
定了理论基础。
[关键词 ] stathmin； RNA干扰； 骨肉瘤； 培养的肿瘤细胞； 移植瘤； 小鼠
中图分类号：R73—34 文献标识码：A 文章编号：1007—3639(2009)01—0006～06
Construction of siRNA expression vectors targeting stathmin and its influcence on biological
behaviour in LM8 cells 伽 Biao， ．5例0 Zeng—WU， M “-huM，LIU Yong (Department of
Orthopaedic Union Hospital Xongji Medical College ttuazhong Lbiversity of Science and
Yechnology, Wuhan Hubei 430022, ina)
Correspondence to：SHA0 Zeng—wu E-mai1：sz,jj#medmai1．COfiL CH
[AbstracQ Background and purpose：Stathmin is expressed at high levels in many kinds ofhuman cancers．
Inhibition of stathmin expression in malignant cells results in reduced cellular proliferation and induces apoptosis．
This study was to construct silence—small interfering RNA(siRNA)expressing vector and observe the expression of
stathmin gene and its influence on biological behavior in LM 8 cel line after the vector transfection．M ethods：The
designed siRNA expression vector targeting stathmin gene were constructed．The recombinant vectors of pGenesil一1·
Stathmin and pGenesil一1一HK were transfected by liposome—mediated method into the LM8 osteosarcoma cell line．The
expression of stathmin at the levels of mRNA and protein were detected by real—time quantitative PCR and Western
blot．The cellular growth inhibiting rates in vitro were assayed by MTT colorimetry．The celular growth activities were
assayed by vitro clonogenic assays．The morphological assessment of apoptosis was studied by Hoechst staining and
HE staining．The cell cycle was analysed by FCM ．C3H mice—transplanted tumors were used to estimate the kinetics
of cancer formation of tumours of the three kinds of cels．Results：The siRNA expression vectors of pGenesil一1一
Stathmin was successfuly constructed and confirmed by the DNA sequencing．Stathmin mRNA and protein after
transfection were obviously down—regulated in the LM 8 cells transfected by pGenesil—l—Stathmin plasmid．The
cellular growth inhibiting rates increased obviously．The celular growth activities decreased obviously in soft agar
通讯作者：邵增务 E—mail：szwjj@medmail com．cn
中国癌症杂志 2009年第19卷第1期
culture．Hoechst and HE staining showed that apoptosis was induced after transfection．The cells at G2／M phase were
signifcantly higher than those in the negative control group transfected with pGenesil-1-HK and the nontransfected
group．The formation rate of C3H mice—transplanted tumor mice slowed down signifcantly by transfection of pGenesil。
1-Stathmin． Conclusion：pGenesil一1一Stathmin expression vectors targeting stathmin were successful constructed．The
inhibitory efect of siRNA on the LM 8 cels transfected by pGenesil．1一Stathmin expression vectors was COnfirmed and
the transfection also had impacted on biological behaviour of cels like tumor growth，this may served as a biological
basis for the application in the gene therapy of osteosarcoma．
[-Key words] stathmin； RNA interference； osteosarcoma； cultured tumor cells； transplanted tumor；
mjce
Stathmin蛋白是一种新发现的微管不稳定
蛋白，对细胞微管系统动态平衡的调节发挥十
分重要的作用，并藉此高效调节细胞的增殖与
分化。Stathmin蛋白在多种恶性肿瘤细胞中都
有高水平表达，通过抑制其表达可以干扰恶性
肿瘤细胞的有丝分裂，使细胞分裂停止于G，／
M期，从而影响肿瘤细胞的增殖。已有研究表
明，反义核酸技术抑~1]stathmin表达能消除白
血病细胞表型的改变并能抑制白血病细胞在
活体致瘤特性 ⋯ 。腺病毒介导的抗stathmin核
酶转染前列腺肿瘤细胞后stathmin基因表达明
显下降，肿瘤细胞生长与增殖明显抑制 ，细
胞分裂停滞在G，／M期，并与其有明显的剂量
依赖性 J。RNA干扰是目前最有效的基因沉
默技术，能高效、持久、特异性地抑制靶基因
转录，从而下调相应蛋白水平及功能。RNA干
扰作为新兴的基因阻断技术正广泛应用于基因
功能及基因治疗的相关研究 。本研究应用
RNA干扰技术，探讨构建pGenesil一1一Stathmin
重组质粒转染骨肉瘤LM8细胞系后对其生物学
特性的影响
1 材料和方法
1．1 主要试剂和细胞 真核质粒载体pGen—
esil一1购于武汉晶赛生物技术有限公司。脂质
体Lipofectamine200O(Invitrogen公司)，RT—PCR
相关试II(Ii京中山生物公司)，噻唑蓝 (华美公
司 )，RPMIl640(Gibeo公司1，BamH I、Hind
lI、T4DNA连接酶 (Takara公司)，stathmin抗
体(武汉博士德公司)，胶回收试剂盒 (Omega公
司 )，RNA干涉试剂盒 (Ambion公司 )。C3H
鼠源性骨肉瘤LM8细胞系由我院骨科实验室保
存提供。C3Hdx鼠由我院实验动物中心提供并
饲养。
1．2 细胞培养 骨肉瘤 LM8细胞置含10％胎
牛血清的PRMI 1640培养液(100 g／ml青霉素
和100 g／ml链霉素)，37℃、5％CO2温箱中培
养。每2～3 d用0．25％胰酶消化传代。实验采用
对数生长期细胞。
1．3 Stathmin—siRNA表达载体的构建和
LM8细胞稳定转染 GenBank(NM一019641)
查序获得stathmin的mRNA序列，设计出针
；~stathmin RNAi的一个特异性靶点：AAA—
GAAGAAGGACCTTTCCCT(G／C=42．9％)。
siRNA插入序列上游限制位点为BamH I，下
游限制位点为Hind BI，Loop序列为TTCAA—
GACG。合成模板结构为：stathmin正向序列为
5’一GATCCAGAAGAAGGACCTTTCCCTTTCAA—
GACGAGGGAAAGGTCCTTCTTCTTTTTTTGTC—
GACA一3’；反向序列为5’一AGCTTGTCGA—
CAAAAAAAGAAGAAGGACCTTTCCCTCGTCT-
TGAAAGGGAAAGCTCC IvrCTTCTG一3’。设计的
通用阴性对照HK正向序列为5l_GATCCGACT—
TCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCAT—
GCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA一3’，反
向序列为5I_AGCTTGTCGACAAAAAAGACT—
TCATAAGGCGCATGCCCTCTTGAAGCAT—
GCGCCTTATGAAGTCG一3’。根据SiRNA靶点人
工合成一对互补并编码短发夹siRNA的寡核苷
酸链，并溶解于50 l annealing bufer。各取2 l
(模板序列+反向序列 )+l6 l annealing bufer
混匀。94 水浴退火自然冷却至室温后与线性
化pGenesil—l质粒载体连接。连接产物转化感
受态细胞DH5 a，筛选Kana 抗性克隆。提取质
粒，Sal I酶切鉴定后DNA测序。测序证实后
按Lip0fectamine2000脂质体转染方法将重组质
粒和阴性对照质粒转染处于对数生长期LM8细
胞，G418培养基中筛选约4周获得抗性克隆细
胞。G41 8浓度200 g／ml维持培养。 将转染重
组质粒、阴性对照质粒及未转染的LM8细胞分
别命名为S—LM8、HK—LM8和LM8对照。
车彪，等． Stathmin siRNA表达载体的构建及对LM8细胞生物学行为的影响
1。4 实时荧光定量PCR及Western印迹技术
检测 stathmin基因表达应用SYBR Green I荧
光染料技术行实时荧光定量PCR反应，获取各
组细胞stathmin基因fl~PCR实时荧光扩增标准
曲线，计算机分析各组Ct值并计算 各组2屯
值，即实验组相对于内对照 B—actin stathmin
目的基因表达的变化倍数 。stathmin基因
上游引物为：5l_ATAGGTAGATCCAGACCGT—
GAG一3’；下游引物为 ：5’一GAACTAGCCAT—
TAACCCAGCAC一3’。内参 B—actin上游引物为：
5’一GAAcGGTGAAGGTGACAG一3’下游弓I
物为：5’一TAGAGAGAAGTGGGGTGG一3’。
Western blot按常规方法进行。
1．5 MTT比色分析检测细胞体外生长抑制率
将各组l X 104／talON胞接种于96-fL板，每孑L
0．1 ml，每组平行6：fL，温育48 h后弃上清，每
；fLDI~2O l新配制的5 g／L MTT，温育4 h后弃上
清，加150 1 DMSO用酶标仪测490 nIi1波长处
吸光度 ( )值，计算细胞生长抑制率。细胞
生长抑制率=(1一实验孑 值／对照孔 值)×100
％ 。
1．6 细胞增殖分裂的检测(软琼脂集落形成实
验) 去离子水制备1．2％~130．7％低熔点琼脂糖
液，高压灭菌后维持在37℃水中；无菌制备
2 X DMEM，维持在37℃水中；1：1混合1．2％
琼脂糖和2×DMEM，取3 ml注入直径6 cm的平
皿中，冷却凝固，置温箱中备用；1：1比例无
菌试管中混合0．7％琼脂和2×DMEM后向管中
加入0．2 ml的细胞悬液，充分混匀后注入含有
1．2％琼脂糖底层平皿中，使细胞为50个／孑L，各
设5个复孔。上层琼脂凝同后，置温箱培养14
d。倒置显微镜下观察集落形成情况。判断标
准：含50个细胞以上的细胞克隆为一个集落，
计算集落形成率。集落形成率=(集落形成数／接
种细胞数)×100％。
1．7 细胞HE染色 胰酶分别消化上述3组细
胞，细胞悬液加入64L板巾的盖玻片上；于温
箱中培养48 h，制成细胞爬片后4％多聚甲醛固
定；常规HE染色后二甲苯透明、封片观察。
1．8 Hoechst法检测细胞凋亡 洁净盖玻片置
于6：fL板内，分别种人以上3组细胞过夜，使细
胞约为80％满，然后按Hoechst 33258染色试剂
盒说明书操作。激发波长在350 nil，发射波长
在460 nm左右。每张切片随机选择10个视野高
倍镜细胞中的阳性细胞数，其阳性细胞数与总
细胞数之比即为凋亡指数。
1．9 流式细胞术定量分析细胞周期 收集以
上3组细胞，PBS吹打后定量为(1～2)X 10。个／
ml，低速(900 g)离心5 min后重悬细胞，调整
细胞至5 X 10。个／ml；加人RNase(0．1 mg／ml 1100
l，37℃水浴30 rain后DIP1 0．5 ml混匀，室温
暗处温育染色30 min，FACS流式细胞仪计数，
细胞周期以百分率记录数据。
1．1 0 C3H／J~鼠移植瘤实验 选取4～6周龄C3H
小鼠，雌雄不限，分3组，每组6只。收集以上
3组细胞，PBS洗涤后低速(900 g)离心5 min，
共3次后重悬细胞，计数细胞1×10 个并调整为
0．3 ml细胞悬液接种于C3H／b鼠右上肢背部皮
下，连续观察4周，记录肿瘤出现时间，测量
瘤体长径 (L)与短径(W)。处死动物，称瘤体
重量并计算肿瘤体积。肿瘤体积 (V)=(长
径 ×短径 )×0．52。肿瘤组织行HE染色。
1．1 1 统计处理 采用SPSS13．0统计学软件进
行分析，数据以均数 ±标准差 )表示，数据
两两比较采用配对资料f检验分析，P<0．05为
差异有显著性。
2 结 果
2．1 Stalhmin siRNA表达质粒的测序鉴定
重组质粒测序分析证实已将针对stathmin mRNA
序列设计的寡核苷酸双链克隆．~pGenesil一1真
核质粒载体中，符合预期设计，重组质粒构建
成功。
2．2 pGenesil一1一stathmin转染对骨肉瘤细
胞LM8细胞系stathmin基因沉默效果 实时荧
光定量PCR和Western印迹(图1)技术分别检测
siRNA转染骨肉瘤细胞后stathmin基因在mRNA
和蛋白水平上的表达。S—LM8、HK—LM8和
LM8对照组2。△ 值分别为：0．02±0．1 1、
0．62±0．12和0．51±0．12；前组与后两组 (n=6)
比较f值分别为10．759和8．572，P值均为0．000，
差异有显著性。而后两组比较t值为0．643，P
值为0．53 1，差异无显著性；stathmin／B—aetin
相对吸光度比值分别为：0．1 61±0．002、
0．5 1 8±0．009和0．526±0．007。前组与后两组
(n=1o)t值分别为65．942和176．570，P值均为
0．000，差异有显著性。而后两组f值为1．914，
P值为0．088，差异无显著性。stathmin基因在蛋
白水平的沉默效率约为75％。
“中 国 癌 症 杂 志》 2 0 0 9 年第 1 9 卷 第 1 期 9
F i g ． 1 E f f e c t 0 f s t a t h m i n s i R N A 0 n S t a t h m i n p r o t e i n
e x p r e s s i 0 i n L M 8 c e l l s
2 ． 3 S t a t h m j n 基 因 沉 默 对 骨 肉瘤 细 胞 增 殖
活 性 的 影 响 S — L M 8 细 胞 增 殖 能 力 明 显 降
低 ， 而 H K — L M 8 和 L M 8 对 照 组 细 胞 依 然 保 持
较 高 的 增 殖 活 性 。 M T T 法 测 定 S — L M 8 、 H K —
L M 8 的 生 长 抑 制 率 分 别 为 ( 2 6 ． 0 ± 1 ． 6 ) ％ 和
( 1 ． 7 8 ± 0 ． 2 0 ) ％ ， 两 组 间 比较 f 值 为2 0 ． 7 1 6 ， 尸
值为0 ． 0 0 0 ， 差 异有 显 著性 。
2 ． 4 集 落 形 成 实 验 倒 置 显 微 镜 下 观 察 到
S — L M 8 组 细 胞 在 软 琼 脂 中散 在 分 布 ， 细 胞 生
长 缓 慢 ， 形 成 集 落 规 模 大 小 不 一 ， 集 落 细 胞
组 成 相 对 少 ， 而 其 他 两 组 细 胞 生 长 状 态 基 本
一 致 ， 细 胞 集 落 形 成 较 大 ， 呈 团 块 状 f 图 2 ) 。
S — L M 8 、 H K — L M 8 和 L M 8 对 照 组 集 落形 成 率 分
别 为(4 3 ． 8 士 2 ． 5 )％ 、 (6 4 土 3 )％ 和 (6 6 土 4 )％ ， 前
组 与后 两 组 比较 f 值分 别 为 1 3 ． 2 2 和 1 3 ． 6 8 ；尸值均
为 0 ． 0 0 0 ， 差 异 均 有 显 著性 ； 而 后 两 组 间 比 较 ，
值 为2 ． 4 9 0 ， P 值 为0 ． 0 6 8 ； 差 异 无 显 著性 。
2 ． 5 H E 染 色 检 测 可 观 察 到 S — L M 8 组 细 胞 排
列 明显 疏 松 ， 部 分细 胞 形 态 变小 、 皱 缩 、 胞 质
内出现 空 泡 、 核 碎 裂 、 核 溶 解 ， 呈 典 型 的凋亡
细 胞 形 态 学 变 化 。 而 H K — L M 8 和 L M 8 对 照 组 细
胞 上 述 表 现 则非 常少 见 ， 细胞 呈 梭形 、 胞 核 大
而 圆 、 核浆 比例较 大 、 核仁多 、 排 列 密集 、 折
光 性好 f 图3 ) 。
2 ． 6 H o e c h s t 法 检 测 细 胞 凋 亡 可 观 察
到 s — L M 8 组 有 较 多 的 凋 亡 细 胞 ( 凋 亡 细 胞
的 核 浓 集 H o e c h s t 着 色 而 呈 亮 兰 色 ， 或 核
呈 分 叶 ， 碎 片 状 ， 边 集 ； 正 常 细 胞 核 的
H o e c h s t 着 色 的 形 态 呈 圆 形 ， 淡 兰 色 ) (图4 ) 。
S — L M 8 、 H K — L M 8 和 L M 8 对 照 组 细 胞 凋 亡 指
数 分 别 为 ( 1 5 ． 7 ± O ． 5 ) ％ 、 ( 6 ． 1 ± 0 ． 4 ) ％ 和
( 6 ． 2 ± 0 ． 4 ) ％ ， 前 组 与后 两 组 比较 ， f 值分别
为4 0 ． 7 2 5 和 3 1 ． 1 4 6 ， P 值均 为0 ． 0 0 0 ， 差 异 均 有
显 著性 ； 而 后 两 组 问 比较 ，值 为 0 ． 4 9 6 ， P 值 为
O． 6 3 1 ， 差 异 无 显 著性 。
2 ． 7 流 式 细 胞 仪分 析 细 胞 周 期 (图 5 )S — L M 8 组
较 H K — L M 8 和 L M 8 对 照 组 G ：／M 期 细 胞 比 例 明显
增 加 ， 达 ( 1 6 ． 2 ± O ． 4 )％ ； 而 H K — L M 8 和 L M 8 对 照
组 分 别 为(6 ． 5 ± 0 ． 3 1 ％ 、 ( 6 ．3 ± 0 ． 4 ) ％ ， 前 组
与后 两 组 比较 ， f 值分别 为 2 7 ． 2 0 0 和 5 7 ． 9 4 l ；Jp 值
均 为 0 ． 0 0 0 ， 差 异 均 有 显 著性 ； 而 后 两 组 间，值
为0 ． 8 5 3 ， P 值 为0 ． 4 4 2 ，差 异无 显 著性 。
2 ． 8 C 3 H 小 鼠移 植 瘤 实验 结 果
2 ． 8 ． 1 肿 瘤 细 胞 成 瘤 能 力 下 降 细 胞 接 种 后
图2 软琼 脂 集 落 形 成 实 验 显 示 单 个细 胞 体外增 殖 活 力
F i g ． 2 T h e c e l I u l a r g r o w t h a c t i V i t i e s w e r e a s s a y e d b y 胁 V 矗l，D c 10 n o g e n i c a s s a y s i n s o f t a g a r c u l t u r e (
× 10 0 )
图3 H E 染色 观 察部 分 细 胞 呈 典型 的凋 亡 细胞 形 态 学 改变
F j g ． 3 T h e m o r p h o l o 西c a J a J t e r a t i o n o f c e Jb w a s s t u d j e d b y H E s t a i n i n g
A ：L M 8 c e Us ：B ：H K - L M 8 ：C ：S — L M 8 ．
车彪 ， 等 ． s t a t h m i n s i RNA 表达载体 的构 建及对L M8 细胞 生物学行为的影响
图4 细胞 H o e c h s t 法显 示 细胞 凋 亡 形 态学特征
F i g - 4 T h e m O r p h o l o g i c a I c h a r a c t e r i s t i c O f a p o p t O s i s w a s s t u d i e d b y H O e c h s t s t a i n i n g
A ：L M 8 c e l l s ：B ：H K — L M 8 ：C ：S ． L M 8 ．
A ：L M
盏
E
图5 流 式 细胞 仪分 析细 胞 周 期
11j g ． 5 T Jl e c e l J c y c l e w e r e a n a Jy s e d b y F C M
A ：L M 8 c e n s ：B ：H K ． L M 8 ：C ：S — L M 8
图 6 移 植瘤 组 织 的 H E 染色
：
湖
豢麟
F i g � 6 T h e h i s t i o c y t e i n t r a n s p l a n t a t i O n t u m O r w i t h H E s t a i n i n g
1 周 即 见 H K — L M 8 和 L M 8 对 照 组 6 只 C 3 H 小 鼠移
植 部 位 皮 下 均 出现 移 植 瘤 ， 成瘤 率 1 0 0 ％ ： 而
S — L M 8 组 约 在 3 周后 才 见 肿 瘤生 长 ， 而 且 只 有 3
只 成瘤 。 4 周后 移植 瘤 的体 积 和 移 植 瘤 重 量 见
表 1 。 S ～ L M 8 组 与 其 他 两 组 比较 ： 移 植 瘤 体 积
差 异 均 有显 著性 ( ≠值分 别 为 2 4 ． 3 4 1 和 1 5 ． 5 8 7 ，
尸值均 为 O． OOO ) ； 而 H K — L M 8 和 L M 8 对 照 组 间
差 异 无 显 著性 ( f 值 为 1 ． 6 0 4 ， 尸值 为0 ． 1 7 0 ) ； 移
植 瘤 重 量 差 异 均 有 显 著性 ( f 值 分 别 为 2 7 ． 7 8 7
和 1 7 ． 7 6 1 ， P 值 均 为 0 ． 0 0 0 ) ， H K — L M 8 和 L M 8
对 照 组 间 差 异 无 显 著性 ( f 值 为 0 ． 5 1 3 ， P 值 为
0 ． 6 3 0 ) ．
(× 2 0 0 )
表 1 三 种 L M 8 细胞 的不 同生长 情况 和 致瘤性
T la b ． 1 T h e d i f lf e r e n c e g r o w t h a n d 0 n c o g e n i c i t y i n t h r e e
l ‘i n d s 0 f L M 8 c e l Is C_．b )
G r o u p C 3 H m i c e o n c o g e n i c i ty (a n e r 4 w e e k s )
O n c o g e n i c i t y f a ce Ⅵ ) Iu m 0 (Ⅱ l I l l
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l n e ， V a l u e J e s s t h a n U ． U I ，a s S
— L M S 一
’
I c o m p a r e d w I 出 L M 8
一 】 a 订d
H K - L M 8 - T ．
2 ． 8 ． 2 形 态 学观 察 肿 瘤 切 面 均 呈 鱼 肉状 ，
H E 染色镜下 发现 L M 8 一 T 和 H K — L M 8 一 T 组 移植瘤
组 织 细胞 生 长 活跃 ， 胞质丰 富 ， 呈 条索状 弥漫
分布 ， 肿瘤细胞 大小不 一 ， 核 大深染 ， 可 见 核
分 裂象 ， 间质 中纤 维结 缔组 织 少 ， 呈 未 明显 分
化癌 改变 ； 而 S — L M 8 一 T 移植 瘤组 织 肿瘤 细 胞 核
...
