HPV 16型E6蛋白诱导PHK多倍体的形成与消除细胞纺锤体检查点无关.pdf

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HPV 16型E6蛋白诱导PHK多倍体的形成与消除细胞纺锤体检查点无关.pdf � 3 8 � 中 国 肿 瘤 临 床 2 0 0 9 年第 3 6 卷第 1 期 HP V 1 6 型 E 6 蛋 白诱 导 P HK 多倍 体 的形 成 与 消 除细 胞 纺 锤 体 检 查 点 无 关冰 摘 要 目 的 :人 乳 头 瘤 病 毒 1 6 型 ( h u m a n p a p i l l o m a v i r u s , H P V 1 6 ) 与 包括 宫 颈 癌 在 内 的 多种 肿 瘤 的 发 生 明 确 相 关 。 诱 导宿 主 基 因组 不 稳 定 性 可 能 是 H P V 1 6 致 瘤 的 重 要 机 制 之 一 。 本研 究 对 H P V 16 型 E 6 蛋 白诱 导人 原 代 角质 形 成 /l~ (p r i m a r y h u m a n k e r a t i n o c y t e s , P H K ) 形 成 多倍 体 以 及 对 P H K 有丝 分 裂 纺 锤 体 检 查 点 的 影 响 进 行 初 步 的 探 索 , 、 方法 :取 正 常人 包皮 组 织 , 分 离表 皮 , 常规 方 法 培 养 P H K 。 脂 质体 介 导 法 将 p B a b e 一 1 6 E 6 质 粒 转 染逆 转 录病 毒 包装 细 胞 P A 3 1 7 , 挑 选 G 4 1 8 抗 性 克 隆 , 检 测 病 毒 滴 度 , 将 表达 H P V 16 型 E 6 蛋 白 的 高滴 度 逆 转 录病 毒 感 染 P H K 。 通 过 逆 转 录 P C R 法 和 免 疫 印迹 法 证 实 H P V 1 6 E 6 成 功 感 染 P H K 。 P H K 经 N o c o d a z o l e 处 理 后 , 利 用 流 式 细 胞 仪 分 析 多倍 体 形 成 , 于 不 同 时 问 点 收 集 细 胞 、 固 定 , 进 行 抗 磷 酸 化 组 蛋 白 染 色 , 利 用 流 式 细 胞 仪 分 析 细 胞 有 丝 分 裂指 数 差 异 结 果 : H P V 1 6 型 E 6 成 功 感 染 P H K , 并呈 功 能 性 表 达 。 H P V 1 6 型 E 6 可 诱 导 P H K 形 成 多倍 体 , 表达 E 6 蛋 白 的 P H K 和 对 照 细 胞 以 相 似 的 动 力 学进 入 和 退 出有 丝 分 裂 。 结 论 :H P V 1 6 型 E 6 对 P H K 有丝 分 裂过 程 中的 纺 锤 体 检 查 点 无 直接 影 响 , 鉴 于 有 丝 分 裂后 期 检 查 点 在 细 胞 有 丝 分 裂过 程 中较 持 久 和 严 格 的 作 用 , 本研 究 结 果 提 示 , 对 有 丝 分 裂后 期 检 查 点 的 作 用 可 能 是 H P V 16 型 E 6 蛋 白 诱 导 宿 主 细 胞 多倍 体 形 成 的 重要 机 制 。 为 进 一 步探 讨 H P V 相 关 肿 瘤 的 分 子 发 生 机 制 奠 定 了 一 定 基 础 。 关 键 词 人 乳 头 瘤病 毒 E 6 蛋 白 原 代 角质 形 成 细 胞 细 胞 周 期 检 查 点 多倍 体 d o i :10 . 3 9 6 9 ~ . i s s n . 1 0 0 0 - 8 1 7 9 . 2 0 0 9 . 0 1 . 0 1 l H P V 1 6 E 6 P r o t e i n I n d u c e s P o l y p l o i d y T h r o u g h a M e c h a n i s m t h a t D o e s N o t I n v o l v e A b r o g a t i n g M i t o t i c S p i n d l e C h e c k p o i n t s i n P r i m a r y H u m a n K e r a t i n o c y t e s C H E N L in g ’ , S H E N Z h u 。 , W U J in j in ’ C o r r e s p o n d in g a u t h o r :S H E N Z h u , E — m a il :s h e n z h u x a @ g m a il . c o m ’ D e p a r t m e n t o f D e r m a t o lo g y , In s t it u t e o f B a f le S u r g e ry , D a p i n g H o s p it a l , T h ir d M il it a ry M e d ic a l U n iv e r s it y , C h o n g q in g 4 0 0 0 4 2 , C h in a 。 D e p a rt m e n t o f D e r m a t o lo g y , S o u t h w e s t H o s p it a l , T h ir d M ilit a ry M e d ic a l U n iv e r s it y , C h o n g q in g 4 0 0 0 4 2 , C h in a G r a n t s u p p o rt :N a t io n a l N a t u r a l S c ie n c e F o u n d a t io n o f C h i n a (3 0 5 7 2 1 1 2 , 3 0 6 0 0 5 5 8 ) A b s t r a c t 0 b j e c t i v e : H u m a n P a p illo m a v ir u s t y p e 1 6 (H P V 1 6 ) is in v o lv e d i n t h e p a t h o g e n e s is o f s e v e r a l n e o p la s m s , in c lu d in g c e r v ic a l c a n c e r . In d u c t io n o f g e n o m ic in s t a b ilit y m a y b e o n e o f t h e m a in m e c h a n is m s in � v o lv e d in t h is p r o c e s s . T h e a im o f t h is s t u d y is t o in v e s t ig a t e t h e im p a c t o f H P V 1 6 E 6 o n p o ly p lo id y a n d m it o t — ic s p in d le c h e c k p o in t s in p r im a ry h u m a n k e r a t in o c y t e s f P H K ). M e t h o d s : P H K w e r e is o la t e d f r o m h u m a n p r e — p u c e a n d c u lt u r e d b y r o u t i n e m e t h o d s . T h e p B a b e - 1 6 E 6 v e c t o r w a s f i r s t t r a n s f e c t e d in t o t h e r e t r o v ir u s p a c k — a g in g c e ll lin e P A 3 1 7 u s in g l ip o f e c t a m in e t r a n s d u c t io n . G 4 1 8 - r e s is t a n t c o lo n ie s w e r e p ic k e d a n d a s s a y e d f o r v ir u s t it r a t io n . P H K w e r e t h e n in f e c t e d w it h t h is r e t r o v ir u s e x p r e s s in g H P V l 6 E 6 . P o ly p lo id y w a s d e t e c t e d b y f lo w c y t o m e t ry a n d t h e m it o t ic in d e x w a s a n a ly z e d w it h p h o s p h o � h is t o n e H 3 s t a i n in g a n d f lo w c y t o m e t r y a t d if - f e r e n t t im e p o in t s . R e s u l t s : P H K w e r e s u c c e s s f u lly in f e c t e d b y H P V l 6 E 6 . H P V l 6 E 6 c a n in d u c e p o ly p lo id y in P H K . P H K in f e c t e d b y p B a b e . 1 6 E 6 o r e m p t y v e c t o r e n t e r e d in t o m it o s is w it h s im ila r k in e t ic s . C o n c l u s i o n : H P V 1 6 E 6 p r o t e in i n d u c e s p o ly p lo id y t h r o u g h a m e c h a n is m t h a t is n o t r e la t e d t o a b r o g a t in g m it o t ic s p i n d le c h e c k p o in t s in P H K . T h e s e r e s u lt s s u g g e s t f u rt h e r e x p lo r a t io n o f t h e m e c h a n is m b y w h ic h H P V o n c o g e n e s in — d u c e p o ly p lo id y in H P V - r e la t e d n e o p la s m s is n e e d e d . K e y w o r d s H u m a n p a p il lo m a v ir u s ;E 6 p r o t e in ;P r im a ry k e r a t in o c y t e ;C e l l c y c le c h e c k p o in t ;P o ly p lo id y } 本 文 课 题 受 国家 自然 科学基 金 资助 ( 编号 :3 0 5 7 2 1 1 2 , 3 0 6 0 0 5 5 8 ) ① 第 三 军 医 大学西 南 医 院皮肤科 通 讯 作 者 :沈柱 s h e n z h u x a @ g m a i l . c o n l 2 0 0 9 年 第 3 6 卷第 1 期 H P V 1 6 型 E 6 蛋 白 诱 导 P H K 多倍 体 的 形 成 与 消除 细 胞 纺 锤 体 检 查 点 无 关 � 3 9 � 基 因 组 不 稳 定 性 是 恶 性 肿 瘤 的 重 要 标 志 , 其形 成 与细胞 周期 检 查 点 的 功 能密 切 相 关 , 被 认 为是肿 瘤 发生 多 步骤 过 程 中的 一 种 驱 动力 量 , 是 加 速 细胞 癌基 因 的活 化 和抑 癌基 因 突变 的累积 过 程 ⋯ 。 基 因 、 组 不 稳 定 性 在 形 式 上 表 现 为 非 整 倍 体 或 多倍 体 。 宫 颈 癌 等 H P V 相 关 性 肿 瘤 的早 期 常有 多倍 体 的 出 现 怛。 。 H P V 1 6 型 与 包 括 宫 颈 癌 在 内 的 多 种 肿 瘤 的 发 生 已 明确相 关 ¨ ' “ , 但其诱 导 肿 瘤 的机 制 尚不 完全 清楚 。 本研 究 就 H P V 16 型 E 6 蛋 白诱 导 人 原 代 角质 形 成 细 胞 (p r i m a r y h u m a n k e r a t i n o c y t e , P H K ) 形 成 多 倍 体 以 及 对 有 丝 分 裂 纺 锤 体 检 查 点 的 影 响进 行 了 初 步探 索 。 1 材 料 与方 法 1 . 1 材料 p B a b e 一 1 6 E 6 质 粒 由 U n i v e r s i t y o f M a s s a c h u s e t t s M e d i c a l S c h o o l 提 供 , 该 质 粒 含 H P V 1 6 型 E 6 全 长 约 5 0 0 b p 开 放 渎框 。 脂 质 体 转染 试 剂 盒 、 角 质 形 成 细 胞 无 血 清 培 养 基 K C — S F 和 G 4 1 8 均 购 自 G i b c o 公 司 。 L u m i n o l 发 光 试 剂 盒 、 鼠 抗 人 H P V l 6 型 E 6 和 p 5 3 单 克 隆抗 体 购 自 S a n t a C r u z 公 司 。 抗 磷 酸 化 组 蛋 门 H 3 抗 体 和 P o l y b r i n e 购 自S i g m a 公 司 。 1 . 2 重 组 质粒 的鉴 定 质 粒 提 取 试 剂 盒 提 取 p B a b e — p u r o 和 p B a b e 一 1 6 E 6 质粒 , 以 E c o R I 和 B a m H I 双 酶 切 , l Og /L 琼脂糖 电 泳进行鉴 定 , 目的片段 并进 行 D N A 测 序核实 。 1 _3 P H K 细胞 的原 代培 养 取 正 常人 包 皮 ( 泌 尿 外 科 门诊 手 术 室 ) , 消毒后 尽 量 剪 去 皮 下 组 织 , 置 2 . 5 g /L d i s p a s e 中 4 ℃ 消 化 过 夜 。 次 日分 离 真 表 皮 , 将 表 皮 部 分 用 2 . 5 g /L 胰 蛋 白 酶 消 化 , 分 离 角 质 形 成 细 胞 , 以 1 X 1 0 ~ /L 接 种 于 K C — S F 中培养 。 1 . 4 感 染 P H K 细胞 将 空 载 体 p B a b e — p u r o 和 p B a b e 一 1 6 E 6 质 粒 各 5 ¨ g 分别用 脂 质 体介 导 法 转 染包 装 细 胞 P A 3 1 7 ( 第 四 军 医 大学 张 惠 中教授 惠 赠 ) , G 4 1 8 ( 1 m g /L ) 对 细 胞 进 行 筛 选 。 当对 照 组 细 胞 死 亡 后 , 将 G 4 1 8 改 为 0 . 5 m g /L , 维持 筛选 5 周 , 挑 选 G 4 1 8 抗 性 克 隆制 备病 毒 液 , 将 收 集 制 备 的 的 各 病 毒 液 相 应 作 1 0 ~ 、 1 0 ~ 、 1 0 。 倍 稀 释 , 分 别 加 入 N I H 3 T 3 细 胞 ( 第 四 军 医 大 学 口 腔 医 学 院惠赠 )培 养瓶 内 , 吸 附 2 h , 继 续培养 7 2 h , G4 1 8 0 . 5 m g /L 筛选 , 4 周后 根 据 克 隆形 成数计算病毒 滴 度 。 选 择 高 滴 度 病 毒 液 ( >5 X 1 0 ’ ) , 按 1 0 、 1 0 、 1 0 。 及 1 0 。 倍 数 进 行 稀 释 , 均 按 l m l 为 总 体 积 , 并 加 入 P o l y b r e n e 8 ¨ g 。 将 准 备 好 的 病 毒 液 加 入 培 养 的 人 角质 形 成 细 胞 表 面 , 培 养 3 h , 添 加 完 全 培 养 基 继 续培养 4 8 h 后 , 加入 G 4 1 8 (0 . 2 m g /L )筛选 。 1 周后 G 4 1 8 降为 0 . 1 m g /L , 维持 筛选 , 挑 选 抗性 克 隆进 行实验 。 1 . 5 R T — P C R 和免疫 印迹 H P V l 6 型 E 6 和 B — a c t i n 的 R T — P C R 参照 文献 [5 ] 进 行 。 E 6 上 游 引物 为 5 ’ 一 C T G C A A T C ‘ 丌 T C A G C A C C C A 一 3 ’ , 下游引物为 5 I_ c c T A A T r A A c A A A T C 一 3 ’ 。 内参 照 B — a c t i n 上 游 引 物 为 5 ’ 一 T G G c A T T G C C G A C A G G A T G C A G A A 一 3 ’ , 下 游引物为 5 I- C T C G T C A T A C l l CCT G C T F G C T G A T 一 3 ’ 。 免疫 印迹 主 要 步骤 为 :裂解 两 组 逆 转 录病毒感染细胞 , 定 量 裂解物 中总蛋 白量 后 , 取 等 量 ( 10 0 ¨ g /L )待测 样 品行 S D S — P A G E 电泳 , 转移 至 硝 酸纤维素膜 , 分别加入 鼠抗人 H P V l 6 型 E 6 和 p 5 3 单克 隆抗体 , 4 ℃ 过 夜 , 加 人 过 氧化物酶标羊抗 鼠 I g G 孵 育 后 , 加 入 L u m i n o l 发 光 试 剂 , K o d a k 胶 片记 录 。 1 . 6 细胞 多倍体形 成 和有 丝 分 裂指数分析 于 培 养 的 P H K 中分 别加 入 D M S O 和 N o c o d a z o l e ( 5 0 斗 g /m 1 ) , 4 8 h 后 收集细胞 , 7 0 % 乙 醇 固定 1 2 h , P B S 重 悬 细 胞 , 碘 化 丙 啶 染 色 ( 5 0 斗 g/m l , 含 7 0 斗 g/m l R N a s e A ) , 流 式 细 胞 仪 分 析 多 倍 体 形 成 。 P H K 经 N o c o d a z o l e 处 理 后 , 分 别 于 不 同时 间点 收集 细胞 、 固 定 。 加 入 抗 磷 酸化 组 蛋 白 H 3 抗 体和 对 应 的 F I T C 标 记 的 抗 鼠 二 抗 , 碘 化 丙 啶染 色 后 , 利 用 流 式 细 胞 仪 检测 并分析有丝 分裂 指数 。 1 . 7 统计 学处 理 利 用 S P S S 1 0 . 0 统 计 软件进 行 资料 的 S t u d e n t ’ S t 分析 处 理 , P ≤ 0 . 0 5 为具 有 统计学 意 义 。 2 结 果 2 . 1 质粒 p B a b e 一 1 6 E 6 的酶切 鉴定 质 粒 p B a b e 一 1 6 E 6 以 E c o R I 和 B a m H I 双 酶切 后 , l Og /L 琼脂糖 电泳可 见 约 5 0 0 b p 的 目的片断和 载体 片 断 , 空 载体 p B a b e — p u r o 质粒 仅 见 载体片 断 ( 图 l a ) , 结 合测序结果 , 证 明所 获质粒确为 p B a b e 一 1 6 E 6 。 2 . 2 感染 P H K P H K 克 隆形 成 时 , 克 隆 内细胞 呈 椭 圆形 及 多 角 形 , 细胞 完 全 融 合后 两 组 细 胞 形 态 均 与正 常 角质形 成 细 胞 类 似 。 R T — P C R 结 果 显 示 仅 在 p B a b e 一 1 6 E 6 感 染 的 P H K 中扩 增 出大 约 3 0 0 b p 的 E 6 目的片段 , 空 载 体 p B a b e — p u r o 、 阴 性 对 照 和 空 白对 照 中均 无 此 条 带 , 阳 性 内参 照 可 见 大 约 17 0 b p 的 B — a c t i n 条 带 ( 图 1 b ) 。 免 疫 印 迹 结 果 显 示 在 p B a b e 一 1 6 E 6 感 染 的 P H K 中 , E 6 蛋 白表 达 阳性 , 而 且 相 对 应 的 p 5 3 低 表 达 , 说 明 p B a b e 一 1 6 E 6 在 感 染 的 P H K 中呈 功 能性 表 达 ( 图 l c ) 。 继 续 培 养 2 周 后 , 空 载体 p B a b e — p u r o 感 染 的 P H K 大 多 数 开 始 角 化 、 逐 渐 死 亡 。 p B a b e 一 1 6 E 6 感 染 的 P H K 随培养时 间 的延 长胞体稍增 大 , 形 态 仍类似 正 常角质形成 细胞 , 增 殖状 态稳 定 。 � 4 0 � 中 国 肿 瘤 临 床 2 0 0 9 年第 3 6 卷第 l 势 ( a ) M :D N A 标准参 照物 , 1 和 2 分 别为 p B a b e 空 载体和 p B a b e 一 16 E 6 质粒经 E c o R I 和 B a m H l 双 酶切 后 。 (b )R T — P C R 结果 , M :D N A 标准 参照 物 , l :p B a b e 一 1 6 E 6 质粒感 染 的 P H K , 2 :p B a b e ~ 载体感 染 的 P H K , 3 和 4 分别 为 阴性 和 空 白对 照 , 1 ~ 4 以 E 6 为 目的基 因 , 5 和 6 分别 为 p B a b e 一 16 E 6 质粒 和 p B a h e 空 载体感染 的 P H K , 以 B — a c t i n 为 目的基 因 。 ( c ) 免疫 印迹 结果 图 1 p B a b e 一 16 E 6 质粒 的酶切 鉴 定 ( a ) 和感 染 P H K 的检测 证 实 ( b 和 c ) F i g u r e 1 I d e n t i fi c a t i o n o f p B a b e 一 16 E 6 r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n ( a ) a n d s u c c e s s f u l i n f e c t i o n o f P H K ( h a n d c ) 2 3 细胞 多倍体形 成和 有 丝 分裂指数分析 p B a b e 一 1 6 E 6 质 粒 感 染 的 P H K 与 p B a b e 空 载体 感 染 的 P H K 比 较 , 前 者 显 著诱 导 多倍 体 的形 成 ( P < 0 . 0 5 , 图 2 a ) 。 而 且 这 两 种 细 胞 在 N o c o d a z o l e 处 理 后 , 在有 丝 分 裂期被捕 获 , 约 16 /J ' 时达 到最 大指数 , 零 碧 恩 蛞 拄 嫡 # 2 约 4 8 小 时退 出有 丝 分 裂 , 表 现 出相 似 的有 丝 分 裂指 数 曲线 ( 图 2 b ) 。 表 明 在 N o c o d a z o l e 处 理 下 , H P V 1 6 型 E 6 诱 导 P H K 多倍 体形 成 和 有 丝 分 裂 纺锤 体检 查 点 无 直 接 关 系 。 时 间 (h ) ( a )# l :t=- 0 . 4 4 3 2 , P =- 0 . 6 8 0 5 ;# 2 :t = 3 . 8 2 0 2 , P = O. 0 1 8 8 。 ( b )纵 坐标代表相 对 于 分裂 间期细胞 ,磷酸化组 蛋 白 H 3 阳性 、 约 D N A 4 倍体细胞 的倍数 图 2 细 胞多倍体形成 分析 ( a ) 和有 丝 分裂指数 曲线 (b )结果 F i g u r e 2 P o l y p l o i d y f o r m a t i o n a n a l y s i s ( a ) a n d m i t o t i c i n d e x r e s u h s ( b ) 3 讨 论 目前 尚无 有 效 的治 疗 H P ~ 相 关 肿 瘤 的方 法 , 虽 然疫苗研 究 的实验 结 果 令人 鼓舞 , 但 H P V 疫苗存在 型 特异性 的 限制 , 而 且 在免疫 抑制者 中可 能无 效 。 因 此 探讨 H P V 相 关 肿 瘤 发 生 的分子 机 制仍具 有 非 常重 要 的意 义 。 H P V E 6 的生 物学 作 用 中研 究 得 最 多 的是 其在 原 代人 上 皮 细 胞 永 生 化 中 的作用 。 E 6 本 身能 够永 生 化 人 乳 腺 上 皮 细 胞 , 与 E 7 协 同能永生 化 H K 。 细 胞 中 E 6 的 表 达 活 化 了 c — M y c , 后 者 可 以 上 调 h T E R T , 导 致 端粒 酶 活 化 , 进 而 使细胞 永 生 化 旧 。 。 但 需 要 强 调 的是 , 尽 管 E 6 协 同 E 7 能 够有 效 地 永 生 化 人 上 皮 细 胞 , 但 它 本 身 不 足 以 诱 导 人 类 细 胞 的转 化 n ’, 推 测 由 E 6 、 E 7 引 起 的 基 因 组 不 稳 定 性 能 使 细 胞 累 积 较 多 的对 恶 性 转 化 非 常 重 要 的 基 因 组 的异 常 。 与此 一 致 的是 , 高危 型 H P V 感 染后 , 只 有 少 数 进 展 为恶 性 损 害 , 而 且 即使 发 生 , 也 通 常有 一 个 非 常 长 的潜 伏 期 , 肿 瘤 的 发 生 需 要 病 毒 的 持 续 性 感 染 , 提 示 宿 主 细 胞 基 因 组 的 异 常 等 因 素在 高 危 型 H P V 相 关 损 害 中起 关键 的作 用 , 它 有 利 于 病 毒 基 因 在 宿 主 基 因组 的整 合 和 持续 性 感 染 的维 持 , 加 速 肿 瘤 的进 展 旧。 。 基 因组 不 稳 定 性 是 恶 性 肿 瘤 的标 志 , 它 在 上 皮 来 源 的肿 瘤 中非 常 常 见 。 基 因 组 不 稳 定 性 的 分 子 郇 咖 咖瑚 ㈣ 瑚 ㈣ 1 ‘ 1 0 0 O O O O∞ ∞ " ∞ 笛 m 1 ‘ 1 加 ∞ ∞ ∞ ∞ 加 m 0 2 0 0 9 年第 3 6 卷第 1 期 H P V 1 6 型 E 6 蛋 白 诱 导 P H K 多倍 体 的 形 成 与 消 除 细 胞 纺 锤 体 检 查 点 无 关 � 4 卜 机 制 尚待 阐 明 , 纺 锤 体损 伤 所 启 动 的 细 胞 周 期 的 “ 停 滞 ” 是 由有 丝 分 裂 过 程 中 的纺 锤 体 检 查 点 和 有 丝 分 裂 后 检 查 点来 实 现 , 这 些 检 查 点 功 能 的丧 失 有 助 于 多倍 体 的形 成 。 真 核 细 胞 有 多 个 细 胞 周期 检 查 点 , 包 括 G 。、 S 、 G :和 上 述 纺 锤 体 检查 点 以 及 有 丝 分裂后 检查 点 。 这 些 检查 点就像 “ 哨点 ” 一 样 , 能将 受 损 伤 的非 正 常细 胞 捕 获 并 停 滞 在 细 胞 周 期 的 特 定 阶段 进 行 损 伤 的修 复或诱 导 其 凋 亡 , 从 而 保证 细 胞 分裂 和 细 胞 周 期 的正 常进 行 , 维 持机 体 的生 理 状 态 。 许 多分 子 参 与 了 检 查 点 功 能 的实 现 , 而 病 理 情 况 下 如 病 毒 基 因 的表 达 则 会 消 除 或 削 弱 检 查 点 的 作用 , 有 助 于 基 因组 不 稳定性 的 出现 ‘⋯ , 从 而 诱导 肿 瘤 的发生 。 H P V 一 1 6 E 6 的表达 与染 色体结构 和数 目的异 常 有 关 。 表 达 H P V 一 16 E 6 和 E 7 的 H K 显 示 发 生 中心 体 的异 常 。 虽 然 E 7 能够迅 速 诱导 中心 体复制错 误 , E 6 却对 中心 体 的数 目有 更 直接 的影 响 。 研 究 表 明 , H K 中 H P V 一 1 6 E 6 的 表 达 诱 导 了 高 频 率 的 有 丝 分 裂 , 且 伴 随着 有 丝 分 裂后 染 色体从 赤 道 板 向 两 极 移 动 的 延 迟 , 后 者在宫颈上 皮 内瘤变和宫颈癌 中也 可 见 到 “⋯ 。 已经 发现 E 6 能够消除多个细胞周期检查点 ““ 。 H P V 一 1 6 E 6 能够 消 除包 括 H K 在 内的 几 个 细 胞 系 中 由 A c t i n o m y c i n D 和 照 射诱 导 的 G 。停 滞 , E 6 降解 p 5 3 的能 力 与 其 阻 断 生 长 抑 制 之 间 存 在 相 关 性 , 提 示 p 5 3 的降解对 于 E 6 消除 G 。停滞非 常重 要 。 人类成纤 维细胞 和 P H K 中 H P V 1 6 型 E 6 的表 达 均 可 诱 导 细胞 多倍 体 的形 成 。 过 去 认 为 E 6 是 通 过 降解 p 5 3 进 而 消 除纺锤 体检查 点 而 诱导 多倍 体 的形 成 “⋯ , 但 本 实 验 结 果 表 明 , 在 P H K 中 , 表 达 E 6 的 细 胞 和 对 照 细 胞 以 相 同 的 动 力 学 进 入 和 退 出有 丝 分 裂 , 提示 H P V 1 6 型 E 6 对 细 胞 有 丝 分 裂 过 程 中 的纺 锤 体检查 点无 明显 影 响 。 鉴 于 有 丝 分 裂 后 期 检 查 点在 细胞 有 丝 分裂 过 程 中较持久 和 严 格 的作用 , 我 们 的结 果 提示 , 对 有 丝 分裂 后 期 检 查 点 的作用 可 能 是 H P V 1 6 型 E 6 诱 导 宿 主 细胞 多倍体形 成 的 重 要 机 制 , 但这 需 要 接下 来 进 一 步 的实验 证 实 。 参考 文 献 l M u r g a M , F e m t n d e z - C a p e t i l l o O . G e n o m i c in s t a b il i t y : o n t h e b i r th a n d d e a th o f c a n c e r [I] . C l i n T r a n s l O n c o l , 2 0 0 7 , 9 (4 ): 2 1 6 — 2 2 0 . 2 D u e n s in g S , M fi n g e r K . C e n t r o s o m e s , g e n o m i c in s t a b il ity , a n d c e r v i c a l c a r c in o g e n e s i s []] . C r i t R e v E u k a r y o t G e n e E x p r , 2 0 0 3 , 1 3 (1 ) :9 — 2 3 . 3 郑 莹 ,彭芝 兰 ,楼 江燕 ,等 . 宫颈癌及 癌前病 变 H P V - 1 6 存在状 态 检测 的研 究 Ⅱ]. 中 国肿 瘤 『临床 ,2 0 0 6 ,3 3 (1 7 ) :9 6 1 — 9 6 5 . 4 张 三 泉, 曾 抗 , 赵 彤 . H P V - 1 6 E 6 /E 7 在 宫 颈 癌 发 生 机 制及 疫 苗 中的研究进展 Ⅱ1. 中国肿瘤 临床 ,2 0 0 4 ,3 1 (1 6 ) :9 5 5 - 9 5 7 . 5 陈 凌 , 沈 柱 , 伍 津 津 , 等 . H P V 5 8 E 6 的 基 因 克 隆 及 H L A - D O B l 。0 3 限制性 T 细 胞 表位 分 析 Ⅱ] . 细胞 与分 子 免 疫 学杂 志 ,2 0 0 7 ,2 3 (1 1 ) :1 0 0 4 - 1 0 0 6 . 6 M c M u r r a y H R , M c C an c e DJ . H u m an p a p il l o m a v i r u s ty p e 1 6 E 6 a c t iv a t e s T E R T g e n e t r an s c r i p ti o n t h r o u g h i n d u c t i o n o f c - M y c an d r e l e a s e o f U S F - m e d i a t e d r e p r e s s i o n []] . J V ir o l , 2 0 0 3 , 7 7 (1 8 ): 9 8 5 2 - 9 8 6 1 . 7 M fi n g e r K , H o w l e y P M . H u m a n p a p il l o m a v i r u s im m o r t a l iz a ti o n an d t r a n s f o r m a ti o n f u n c ti o n s []] . V i r u s R e s , 2 0 0 2 , 8 9 (2 ):2 1 3 - 2 2 8 . 8 s 叫d e r s PJ , S t e e n b e r g e n R D , H e id e m a n D A , e t a1 . H P V — m e d i a 【_ e d c e r v i c a l c a r c in o g e n e s i s : c o n c e p t s an d c l in i c al im p fi c a t i o n s [J] . J P a th o l , 2 0 0 6 , 2 0 8 (2):1 5 2 - 1 6 4 . 9 H a r t w e ll L H . K a s t an M B . C e l l c y c l e c o n t r o l a n d c a n c e r ~] . s c i _ e n c e , 1 9 9 4 , 2 6 6 (5 1 9 2 ): 1 8 2 1 - 1 8 2 8 . 1 0 P l u g _D e m a g g i o A W , M c D o u g a l l J K . n e h u m a n p a p il l o m a v i r u s t y p e 1 6 E 6 o n c o g e n e i n d u c e s p r e m a tu r e m i t o t i c c h r o m o s o m e s e g r e g a t i o n [J] . O n c o g e n e , 2 0 0 2 , 2 1 (4 9 ) :7 5 0 7 — 7 5 1 3 . 1 1 F an X , C h e n J J . R e g u l a ti o n o f c e l c y c l e p r o gr e s s i o n an d a p o p t o s i s b y th e p a p il l o m a v i r u s E 6 o n c o g e n e ~ . G r i t R e v E u k a r y o t G e n e E x p r , 2 0 0 4 , 1 4 (3 ) :1 8 3 - 2 0 2 . 1 2 M c M u r r a y H R , M c C a n c e DJ . D e g r a d a ti o n o f p 5 3 , n o t t e l o m e r a s e a c ti v a ti o n , b y E 6 i s r e q u ir e d f o r b y p a s s o f c r i s i s an d i m m o r t a l i z a - d o n b y h u m an p a p i Uo m a v i r u s t y p e 1 6 E 6 /E 7 [J]. J V i r o l , 2 0 0 4 , 7 8 (1 1 ):5 6 9 8 - 5 7 0 6 . (2 0 0 8 — 0 8 — 0 2 收稿 ) ( 王 展 宏校对 ) ...